2020—2021年江苏省稻曲病菌对三唑类杀菌剂的抗药性监测

潘夏艳　朱凤　周晨　于俊杰　俞咪娜　宋天巧　曹慧娟　刘永锋

摘要：前期研究发现江苏省稻曲病菌对三唑类杀菌剂存在抗药性风险，为进一步明确江苏省稻曲病菌对三唑类杀菌剂的抗药性发展规律，指导全省三唑类杀菌剂的科学使用，利用菌丝生长速率法，测定了2020年江苏省6个地区和2021年江苏省7个地区共计219个稻曲病菌单孢菌株对三唑类杀菌剂的敏感性，并通过测定抗性菌株的生长速率和对水稻的致病力对其适合度进行了分析。结果表明，2020年采集的84株稻曲病菌对丙环唑均敏感；2021年，在靖江市监测到1株抗药性菌株，该市抗性频率为6.7%，全省抗性频率为0.7%；抗性水平2.2倍。进一步对筛选到的稻曲病菌抗药性菌株适合分析发现，抗药性菌株生长和致病力与敏感菌株相比均无显著差异，表明在三唑类杀菌剂的田间选择压下，抗药性可能会进一步发展。本研究明确了江苏省稻曲病菌对三唑类杀菌剂存在低抗药性风险，目前在做好抗药性监测的前提下，三唑类杀菌剂可继续作为江苏省防治稻曲病的主要药剂。

关键词：稻曲病菌；三唑类杀菌剂；抗药性；适合度

中图分类号：S482.2文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2023）05-0134-05

稻曲病是由稻曲病菌（Ustilaginoidea virens，有性态Villosiclava virens）侵染水稻穗部引起的一种世界性真菌病害［1-2］。稻曲病不仅造成水稻严重减产，而且稻曲病菌分泌的毒素会对人畜造成一定的毒害作用［3-5］。近年来由于杂交水稻品种的推广种植、化学肥料的过度使用等因素，我国水稻种植区稻曲病危害不断加重，严重威胁我国粮食安全［6-9］。利用三唑类杀菌剂对稻曲病进行综合防控是当下控制该病害流行的重要措施［10-12］。然而，随着三唑类杀菌剂长期、广泛被使用，笔者所在课题组自2015年起已在江苏省多地监测到稻曲病菌对三唑类杀菌剂的田间抗药性菌株，且具有较高的适合度，表明江苏省稻曲病菌对三唑类杀菌剂存在抗药性风险［13-15］。为进一步明确江苏省稻曲病菌对三唑类杀菌剂的抗药性发生分布范围和抗药性发展规律，本研究连续2年监测了江苏省稻曲病菌对三唑类杀菌剂的抗药性，评估了三唑类杀菌剂防治稻曲病的抗性风险，以期为生产上三唑类杀菌剂的科学使用及抗药性治理策略的制定提供理论指导依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试药剂和菌株

丙环唑原药由南京农业大学提供，用甲醇配成10 g/L的母液，于4 ℃冰箱贮存，备用。

2020年供试菌株为84株。由各地植保站采自江苏省徐州市、扬州市仪征市、南京市、南通市、泰州市靖江市和盐城市东台市6个地区，采样水稻品种为南粳5055、南粳9108、金粳818、徽两优丝苗、春优301、隆两优1686、深两优5814和淮稻5号等12个水稻品种。具体采样情况如表1所示。2021年供试菌株共计135株。由各地植保站采自江苏省徐州市、南京市、淮安市、连云港市、盐城市东台市、南通市和泰州市靖江市7个地区，采样水稻品种为南粳系、荃优系、徐稻系、金陵香粳、金香玉1号、盐粳7号、淮稻5号等20多个水稻品种。具体采样情况如表2所示。

1.2 试验方法

1.2.1 稻曲病菌单孢菌株的分离 用灭菌手术刀将稻曲球对半切开，无菌牙签挑取稻曲球中部白色菌丝块于含50 mg/L卡那霉素的马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA： 1 L中含200 g马铃薯煮沸过滤液、20 g蔗糖和15 g琼脂粉）平板上，于28 ℃培养3～5 d。挑取菌丝块于含50 mg/L卡那霉素的PSB培养液中，28 ℃、150 r/min摇培5 d后，吸取孢子液显微观察产孢情况并将孢子液调至浓度为1.0×104 个/mL，取 1 μL 上述孢子液于100 μL无菌水中混匀后涂布于PSA平板上，28 ℃培养5 d，单个孢子萌发形成的菌落即为稻曲病菌单孢菌株，保存于试管中备用。

1.2.2 稻曲病菌抗药性菌株的筛选 综合分析笔者所在研究室2018年建立的江苏省稻曲病菌对丙环唑的敏感性基线［4］和测定的田间稻曲病菌敏感菌株对丙环唑最小抑制浓度（MIC）0.5 mg/L，本研究将1.0 mg/L作为稻曲病菌对丙环唑田间抗药性监测标准，即能在1.0 mg/L丙环唑含药PSA平板上生长的菌株定为丙环唑的抗药性菌株，不能在含 1.0 mg/L 丙环唑含药PSA平板上生长的菌株定为丙环唑敏感菌株。将供试菌株在28 ℃培养箱倒置预培养15 d，制成5 mm的菌碟后接种于含1.0 mg/L丙环唑含药PSA平板中央，28 ℃倒置培养20 d，观察菌株生长情况。每个处理重复3次。

1.2.3 稻曲病菌对三唑类杀菌剂的敏感性测定 采用菌丝生长速率法测定稻曲病菌对三唑類杀菌剂的敏感性［16］，具体步骤如下：将供试菌株于28 ℃培养箱倒置培养15 d，取直径5 mm菌龄一致的菌碟转移至含系列浓度梯度的丙环唑PSA平板（直径为6 cm）中央，甲醇为阴性对照，丙环唑浓度梯度设置为0.019 5、0.078 1、0.312 5、1.25、5 mg/L。每个浓度梯度3个重复，倒置于28 ℃恒温培养箱培养，20 d后测量供试菌株在不同浓度含药培养基上的菌落直径，并用DPS软件计算丙环唑对各供试菌株的抑制中浓度EC50值。本试验重复3次

1.2.4 抗性水平划分 按照以下公式计算三唑类杀菌剂的抗性频率和抗性水平。

抗性频率=（抗药性菌株数/总菌株数）×100%；

抗性水平=供试稻曲病菌EC50/平均EC50值（平均EC50值为2018年本研究室建立的敏感性基线0.05 mg/L）。

当抗性水平≤1时，该菌株为敏感菌株，当抗性水平>1且≤5时，该菌株为低抗菌株，当抗性水平>5且≤10为中抗菌株，当抗性水平＞10时，该菌株为高抗菌株。

1.2.5 抗药性菌株适合度分析 （1）生长速率测定：将供试菌株于28 ℃培养箱倒置培养15 d，取直径5 mm的菌碟于PSA平板中央，倒置于28 ℃培养箱倒置培养15 d后测量菌落直径并拍照，SPSS软件进行统计分析。每个处理3个重复，本试验重复2次。（2）致病力测定：参照俞咪娜等的方法［17］稍作修改，取新鲜的供试菌株的菌碟于PSB培养液中于28 ℃、150 r/min摇培5 d后，显微观察孢子浓度并调至1.0×106个/mL，然后将菌丝块和孢子液一起打碎作为接种体，注射器接种1 mL接种体至破口前5～7 d的两优培九穗苞中，每个菌株接种10穗，接种30 d后调查每穗稻曲球数并拍照，SPSS软件进行统计分析。本试验重复2次。

2 结果与分析

2.1 江苏省稻曲病菌对三唑类杀菌剂的抗药性监测

本研究共分离获得2020年来自江苏省6个地区的稻曲病菌单孢菌株84株，2021年来自江苏省7个地区的稻曲病菌单孢菌株135株，总计219株。对其抗药性监测结果表明：2020年所有菌株均为敏感菌株，2021年靖江市有1株菌株能在1.0 mg/L含丙环唑的平板上生长，为稻曲病菌对丙环唑的田间抗药性菌株，江苏省稻曲病菌对丙环唑的抗性频率为0.7%，靖江市抗性频率为6.7%（表3）。

2.2 稻曲病菌对三唑类杀菌剂敏感性测定和抗性水平分析

对筛选获得的稻曲病菌抗药性菌株2021-128进行了丙环唑敏感性测定（图1），得出2021-128对丙环唑的EC50值为0.11 mg/L，抗性水平为2.2倍，为低抗菌株。

2.3 稻曲病菌抗性菌株适合度分析

对稻曲病菌抗药性菌株生长速率和致病力测定发现，抗药性菌株2021-128与敏感菌株2021-30相比，生长速率（图2-A、图2-B）和致病力（图2-C、图2-D）均无显著差异，表明该抗药性菌株田间适合度没有降低。

3 讨论

稻曲病主要依赖于化学药剂防控，防治关键时期为水稻穗期，即破口前5～7 d施用丙环唑、戊唑醇等三唑类杀菌剂和井冈霉素为主［18-21］。在其他粮食作物和经济作物病害病原菌中，三唑类杀菌剂的抗性屡见报道，如小麦褐锈菌（Puccinia triticina）、柑橘绿霉病菌（Penicillium digitatum）、瓜类白粉病菌（Sphaerotheca fuliginea）、大麦白粉病菌

graminis f. sp. hordei）等都对三唑类杀菌剂产生了不同程度的抗药性［22-24］。王菲等人曾通过室内紫外诱变的方法，成功获得稻曲病菌对戊唑醇的抗药性菌株［25］。笔者所在研究室通过对稻曲病菌对三唑类杀菌剂多年的田间抗药性监测，于2015年在江苏省淮安市首次监测到2株稻曲病菌对丙环唑的田间抗药性菌株［13］，2017年在江苏省徐州市、淮安市和常州市金坛区以及2019年在江苏淮安市、徐州市、常州市金坛区和连云港市多地均监测到稻曲病菌对丙环唑田间抗药性菌株，且部分抗药性菌株田间适合度高，表明稻曲病菌对三唑类杀菌剂可能存在抗药性风险［14-15］。因此，探明江苏省稻曲病菌对三唑类杀菌剂的抗药性病原群体发生发展规律，对指导科学使用三唑类杀菌剂、高效防控稻曲病具有重要意义。

本研究继续监测了2020—2021年江苏省田间稻曲病菌对三唑类杀菌剂的敏感性，结果表明2020年江苏省各地区未监测到田间抗药性菌株；2021年于江苏省靖江市监测到1株田间抗药性菌株，抗性频率低，且为低抗药性菌株。这表明稻曲病菌对三唑类杀菌剂的田间抗药性发展较慢，目前还没有呈动态上升发展趋势。但是2021年监测到的抗药性菌株适合度较高，在田间三唑类杀菌剂选择压力下，田间抗性可能会发展较快。此外，值得注意的是，较往年，靖江市为新增监测到田间抗药性菌株的地区。从2015年至今，稻曲病菌对三唑类杀菌剂的抗藥性发生范围已从淮安市扩展到徐州市、常州市金坛区、连云港市以及泰州市靖江市，主要集中在苏北地区。综上，尽管稻曲病菌对三唑类杀菌剂抗药性发展缓慢，但介于抗药性菌株的田间适合度和扩展范围，仍需加强我省稻曲病菌对三唑类杀菌剂的抗药性监测，了解抗药性病原群体变化动态，及时采取不同的抗药性治理策略，延缓抗药性的发生发展，从而延长三唑类杀菌剂在我省稻曲病防控中的使用寿命。

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收稿日期：2022-11-30

基金項目：国家自然科学基金（编号：32001943）。

作者简介：潘夏艳（1990—），女，江苏常熟人，博士，助理研究员，研究方向为植物病害防控。E-mail：panxy@jaas.ac.cn。

通信作者：刘永锋，博士，研究员，研究方向为水稻病害病原菌致病机制及绿色防控技术。E-mail：liuyf@jaas.ac.cn。