肾癌来源的IL4I1 介导Treg 诱导与募集的实验研究

来佳丹，魏诗瑶，李常颖

（天津医科大学第二医院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所，天津 300211）

免疫治疗是目前肾癌的重要辅助治疗手段之一，免疫检查点阻断（ICB）治疗如PD－1/PD－L1 免疫疗法，被列入转移性或不可切除性肾透明细胞癌（ccRCC）的一线/二线治疗方案[1]，然而相当一部分患者难以从该疗法中获益。白细胞介素4 诱导蛋白1（IL4I1）是一种分泌性氨基酸代谢酶，因其能在B 细胞上被白细胞介素4 诱导表达而得名，在天然免疫中发挥多重免疫负性调节作用[2－5]。在一项应用帕博利珠单克隆抗体（单抗）联合吲哚胺2，3－双加氧酶1（IDO1）抑制剂治疗晚期恶性黑色素瘤失败的临床研究数据中发现，免疫治疗后肿瘤组织中IL4I1 的表达显著增高，提示其表达可能是影响免疫治疗效果的关键[6]。课题组前期研究发现，IL4I1高表达促进肾癌细胞的增殖和迁移，且与患者不良预后密切相关[7]。然而作为免疫调控因子，IL4I1 是否参与肾癌免疫抑制微环境形成、促进免疫逃逸，尚未见相关报道。本文着力探究IL4I1 在ccRCC 中的表达与其对ccRCC 中调节性T 细胞（Treg）诱导与募集的影响。

1 材料与方法

1.1 数据库分析 利用在线肿瘤免疫浸润数据库TIMER2．0（http：//timer． cistrome．org/）分析ccRCC 中IL4I1 的表达水平与肿瘤中Treg 浸润、Treg 的关键指标CD4、CD25（IL2RA）、FOXP3 以及趋化Treg 浸润的关键趋化因子表达水平之间的相关性。

1.2 细胞系与试剂 人ccRCC 细胞系786－O、胎牛血清（Biological Industries），RPMI－1640 基础培养基、青霉素－链霉素双抗（源培生物），IL4I1 shRNA慢病毒载体（吉凯基因），TRIzol、IC 固定缓冲液、渗透缓冲液10X、反转录试剂盒（ThermoFisher Scientific），FS Universal SYBR Green Master（Roche），PCR 引物（生工生物），IL4I1 检测试剂盒（酶联免疫吸附试验法）（CLOUD－CLONE），抗－IL－4I1/LAO 抗体（Abcam，ab222102），抗β－微管蛋白（C66）mAb（Abmart），PE 鼠抗人CD25、PE 小鼠抗人CD3（BD制药），PE/Cyanine7 抗人CD4、APC 抗人FOXP3（e－Biocience）。

1.3 免疫组织化学法 本研究中使用的组织样本经天津医科大学第二医院伦理审查委员会批准。40例原发性ccRCC 组织切片经过脱腊、水化和抗原修复后，转移至湿盒，3% H2O2室温避光孵育10 min以消除内源性过氧化物酶活性，5% BSA 室温封闭15 min，滴加一抗4℃避光孵育过夜。滴加二抗37℃孵育30 min 后加入DAB 显色、复染，染色结果于光学显微镜下观察并判读。

免疫组化结果判读标准：IL4I1 表达于细胞质中，黄色或棕黄色染色定义为阳性表达。按蛋白表达强弱划分染色强度：不表达，0 分；弱表达，1 分；中等表达，2 分；强表达，3 分。按阳性细胞占视野细胞数量的百分比判定染色面积：无阳性细胞，0 分；＜10%，1 分；10%～25%，2 分；25%～50%，3 分；＞50%，4 分。采用双盲法读片，评分=染色强度+染色面积，1～2 分为（－），3～4 分为（+），5 分为（++），6～7分为（+++）[8]。

1.4 构建IL4I1 敲低表达的肾癌细胞模型 由吉凯基因构建IL4I1 shRNA 慢病毒载体和阴性对照慢病毒载体并进行病毒滴度的检测。人ccRCC 细胞系786－O 于RPMI1640 全培养基（含有10%胎牛血清、1%青霉素－链霉素）中培养。将786－O 以1×105个细胞/孔的密度接种于6 孔板中，至细胞汇合度到30%～50%，更换1 mL 加入5 μL 病毒及40 μL 相应感染增强液的全培养基，继续培养12～16 h 后更换为常规培养基继续培养。用含5 μg/mL 嘌呤霉素的完全培养基筛选具有嘌呤霉素抗性的786－O 细胞，得到实验组786－O－sh 和对照组786－O－ctrl 细胞。所有细胞均置于5%CO2的37℃培养箱中培养。

1.5 Western 印迹 十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）分离蛋白样品后转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜），用含5% 脱脂奶粉的TBST 室温封闭1 h，加入一抗于4 ℃孵育过夜。用辣根过氧化物酶（HRP）耦联的二抗将样品室温孵育1 h后曝光，显影，利用Image J 进一步分析蛋白表达量。

1.6 实时荧光定量PCR（qPCR） 细胞在TRIzol 中重新悬浮和裂解，收集细胞总RNA 测定浓度后使用逆转录试剂盒反转录得到互补DNA（cDNA），加入Fast Start Universal SYBR Green Master 和目标基因引物，按照95℃预变性10 min，95℃15 s，53℃60 s，40 次循环的反应条件进行检测。反应结束后根据△△Ct 法分析基因的相对表达量。所用引物序列见表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.7 有参转录组测序（RNA－Seq） 细胞长至90%左右密度，在培养瓶中加入1 mL Trizol，收集混合物至EP 管中，保存在－80℃备用；每组细胞准备3个重复样，由联川生物进行RNA 测序和初步分析。

1.8 细胞免疫荧光（IF） 细胞接种于灭菌细胞爬片上，4%多聚甲醛固定，0．5%Triton X－100 室温透膜，1%BSA 溶液封闭，加入一抗后于4℃孵育过夜。复温，滴加荧光二抗室温避光孵育1 h，DAPI 孵育5 min 进行核染色，封片后，尽快于荧光显微镜下进行图像观察及采集。

1.9 酶联免疫吸附试验（ELISA） 收集48 h 细胞培养上清液，1 000×g 离心20 min 后收集上清，严格按照ELISA 试剂盒说明书操作，检测实验组和对照组细胞上清液中IL4I1、CCL4、CCL5 蛋白浓度。

1.10 外周血单个核细胞（PBMC）的体外培养 经医院伦理委员会批准、签署知情同意书后收集健康志愿者外周血，通过Ficoll 密度梯度离心法提取PBMC，细胞计数后按照肿瘤细胞∶PBMC=1∶2 的比例将PBMC 接种于含有贴壁786－O 细胞的6 孔板中，加入含有1 000 IU/mL IL－2 的STM 培养基，于37℃培养48 h 后收集细胞进行流式染色检测其中Treg 细胞比例。

1.11 流式细胞术（FCM） 收集含有PBMC 的培养液，4℃PBS 洗涤两遍后，用100 μL PBS 重悬细胞，加入膜蛋白流式抗体，混合均匀后于4℃避光孵育60 min。孵育结束后用预冷PBS 洗涤两遍，加入IC Fixation Buffer 置于4℃冰箱固定30 min。洗涤后，用1×Permeabilzation Buffer 重悬细胞至100 μL，加入胞内蛋白流式抗体，避光，4℃，60 min。冷PBS 洗涤两遍，重悬后上机检测。

1.12 统计学处理 使用GraphPad Prism 9．0 进行统计学分析，以±s 来表示正态分布的计量资料，采用t 检验、χ2检验或方差分析进行组间比较，利用简单线性回归分析两变量之间的关系，P＜0．05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 IL4I1 在ccRCC 中的表达 在前期研究中，课题组运用UALCAN 数据库分析发现，不论从mRNA水平还是蛋白水平，ccRCC 中IL4I1 的表达均显著高于正常肾组织。通过免疫组化进一步验证，染色结果表明与癌旁组织相比，IL4I1 蛋白在肾细胞癌组织中表达水平升高（图1A、B）。ccRCC 组织与癌旁组织中IL4I1 表达水平存在显著差异（χ2=44．56，ν=3，P＜0．001），见表2。

图1 IL4I1 在癌旁及肾透明细胞癌组织中的表达Fig 1 The expression of IL4I1 in paracancerous tissue and clear cell renal cell carcinoma tissue

表2 肾癌和癌旁组织中IL4I1 表达情况的比较[n（%）]Tab 2 Comparison of IL4I1 expression in renal carcinoma and paracancer tissue[n（%）]

2.2 肾癌中IL4I1 表达与Treg 浸润水平的关系 通过TIMER2．0 数据库发现，在ccRCC 中IL4I1 表达与Treg 浸润及Treg 细胞关键指标CD4、IL2RA、FOXP3 都显著正相关（图2A）。免疫组化证实相较于IL4I1 低表达的肾癌组织，在IL4I1 表达增加的ccRCC 切片中可以观察到更多的Treg 细胞浸润（图2B），通过简单线性回归分析发现，IL4I1 表达水平与浸润Treg 细胞数量呈正相关（r2=0．264 8，F=13．69，P＜0．001）（图2C）。

图2 IL4I1 表达与肾癌内Treg 浸润的关系Fig 2 Relationship between IL4I1 expression and Treg infiltration in renal carcinoma

2.3 敲低表达IL4I1 细胞系的构建与转录组测序的富集分析 前期实验结果表明，相较于肾皮质近曲小管上皮细胞系HK－2，ccRCC 细胞系786－O 的IL4I1 表达水平增加[7]。Western 印迹、qPCR 结果显示，转染慢病毒敲低IL4I1 表达后，786－O－sh 组细胞IL4I1 的表达在蛋白水平和mRNA 水平上均比786－O－ctrl 组显著降低（t=17．20，P＜0．001）（图3A、B）。细胞免疫荧光的观察结果也显示，与对照组相比，IL4I1 的表达在实验组786－O 细胞中显著减少（图3C）。利用联川生物平台云工具对RNA－seq 数据进行GSEA 富集分析，结果显示，实验组（786－Osh）和对照组（786－O－ctrl）的差异转录谱在与细胞因子和趋化因子产生及其负性调节相关的基因本体论生物学过程（GOBP）显著富集（P．adjust=9．2×10－4、7．5×10－4、7．7×10－4、2．67×10－2）（图3D、E）。

图3 稳定敲低IL4I1 细胞系的构建及差异转录谱的富集分析Fig 3 Verification of a stable IL4I1 knockdown cell line model and enrichment analysis of transcript differential expression

2.4 IL4I1 表达与Treg 细胞募集的关系 TIMER2．0数据库分析发现，多个与Treg 募集相关的趋化因子CC 亚家族成员与IL4I1 表达呈正相关（图4A）。通过qPCR 检测mRNA 水平上相关趋化因子的变化，观察到敲低IL4I1 表达的肾癌细胞中CCL3、CCL4、CCL5、CCL8、CCL17、CCL19 的表达水平显著下调（t=6．250、7．716、20．640、5．324、6．360、3．484，均P＜0．05）（图4B）。相同条件下培养48 h，786－O－sh 组细胞上清中CCL4、CCL5 的浓度明显低于786－O－ctrl 组（t=6．773、13．64，均P＜0．05）（图4C）。

图4 IL4I1 表达与Treg 募集的关系Fig 4 Relationship between IL4I1 expression and Treg recruitment

2.5 肾癌分泌的IL4I1 对于Treg 的诱导 ELISA结果表明，培养48 h 后，实验组细胞培养上清中IL4I1 浓度低于对照组（t=18．11，P＜0．01）（图5A）。沉默IL4I1 基因表达后，将对照组和实验组细胞分别与PBMC 按1∶2 的比例共培养，与对照组相比，实验组PBMC 中Treg 细胞的比例减少（t=3．843，P＜0．05）（图5B～5D）。

图5 肾癌来源IL4I1 对Treg 的体外诱导Fig 5 In vitro experiment of Treg differentiation induced by IL4I1 derived from renal cancer

3 讨论

肾细胞癌是最常见的泌尿系统肿瘤之一，对传统的细胞毒性化学治疗不敏感。ccRCC 是最常见的肾癌亚型，与非透明细胞肾细胞癌和其他肿瘤类型相比，它是一种高度免疫炎症性肿瘤。丰富的肿瘤浸润淋巴细胞和肿瘤细胞、细胞外基质、分泌的细胞因子等共同构成了与肾癌发生、发展和转移相关的肿瘤免疫微环境。其中，包括Treg 在内的多种免疫细胞直接影响着肾癌免疫治疗疗效和转归。免疫细胞的募集浸润、表型功能受多种因素的调控，如趋化因子、细胞因子等。

作为一种分泌蛋白，IL4I1 可以被免疫细胞或肿瘤细胞合成并释放到肿瘤微环境中，协助免疫抑制性微环境的形成、促进肿瘤进展。在课题组已发表的论文中，笔者通过划痕实验、CFSE 增殖实验证明了IL4I1 高表达对肾癌肿瘤细胞迁移和增殖的促进作用[7]。既往研究证实，IL4I1 可以抑制T 细胞受体（TCR）信号转导，调节幼稚T 细胞分化，限制效应T 细胞增殖，增加T 细胞活化的阈值，参与塑造免疫抑制性肿瘤微环境并削弱抗细胞毒性T 细胞反应，促进肿瘤的免疫逃逸[2，9]。通过γδT 细胞非依赖性的方式，IL4I1 促进髓源性抑制细胞和肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤部位的募集。Yue 等[3]研究显示，IL4I1 可以诱导包括Fizzl、Arg1、MR、YM-1 在内的巨噬细胞标志物的表达，通过抑制M1 型巨噬细胞相关细胞标志物的表达、促进巨噬细胞向M2 型分化，抑制免疫杀伤功能，从而促进癌症的进展[3]。还有研究表明，IL4I1 具备促进T 细胞分化为CD25highFoxp3+CD4+T 细胞（Treg）的能力，黑色素瘤中IL4I1阳性细胞的浸润与Treg 的存在正相关，与肿瘤患者的总生存期呈负相关[10-11]。

课题组运用UALCAN 数据库发现，与正常组织相比，IL4I1 在ccRCC 中的表达升高[7]。TIMER2.0 数据库的分析结果表明，ccRCC 中IL4I1 的表达不仅与肿瘤内Treg 的浸润成正比，也与Treg 的细胞标志物CD4、CD25（IL2RA）、FOXP3 表达正相关。通过免疫组织化学法，笔者验证了IL4I1 在肾癌肿瘤组织中存在高表达；对肿瘤组织连续切片进行IL4I1及Treg 关键分子（CD4 和FOXP3）免疫组化显色，发现在表达IL4I1 的ccRCC 组织中浸润Treg 细胞数量明显多于不表达IL4I1 的ccRCC 组织，即ccRCC 肿瘤组织中IL4I1 的表达与浸润Treg 细胞数量呈正相关，提示IL4I1 可能参与了肾癌中Treg 细胞的募集和表型调控。

IL4I1 是通过何种机制参与了Treg 的募集，值得进一步探究。既往研究表明，可溶性细胞因子、趋化因子可以调控ccRCC 中免疫细胞的募集，在塑造ccRCC 肿瘤微环境和调控免疫细胞浸润中发挥重要作用。血管内皮生长因子A（VEGF-A）表达的增加与ccRCC 中免疫细胞浸润减少相关[12-13]。白细胞介素-8 的增加则有助于形成以中性粒细胞、单核细胞浸润增加，T 细胞浸润和干扰素-γ 减少为特征的免疫抑制性肿瘤微环境[14-16]。Treg 的募集也受细胞因子和趋化因子的调控。在成功构建IL4I1 稳定敲低的786-O 细胞模型后，由联川生物对实验组786-O-sh 细胞和对照组786-O-ctrl 细胞进行RNA 测序。GSEA 发现两组细胞转录本表达谱的差异主要富集在细胞因子产生和趋化因子的产生上，并且与对照组相比，IL4I1 敲低组细胞在细胞因子和趋化因子产生负调节相关的生物学过程转录本中富集。利用在线数据库，笔者分析了ccRCC 中与肿瘤内Treg 浸润相关的趋化因子CC 亚家族成员和IL4I1表达之间的关系。qPCR 结果表明，与786-O-ctrl 组相比，在786-O-sh 组（即IL4I1 敲低表达组）中，CCL3、CCL4、CCL5、CCL8、CCL17、CCL19 的mRNA表达水平显著降低；通过ELISA 进一步证实，786-O-sh 组细胞培养上清中CCL4 和CCL5 浓度明显降低，两项结果均提示IL4I1 高表达的肾癌中Treg 募集相关的趋化因子表达增高可能导致了Treg 浸润的增加。

研究发现，IL4I1 具备促进T 细胞分化为CD25highFOXP3+CD4+T 细胞（Treg）的能力。由此推测肾癌微环境中增加的Treg 也可能是由肿瘤内浸润CD4+T 细胞诱导分化而来。为了探究分泌性蛋白IL4I1 能否将CD4+T 细胞向Treg 诱导，笔者将实验组和对照组细胞分别与PBMC 共培养，结果显示，与786-O-sh 组细胞共培养的PBMC 中Treg 比例明显低于786-O-ctrl 组，提示IL4I1 在CD4+T 细胞向Treg 细胞的分化中起一定的作用。

课题组在之前的研究已经证实IL4I1 可以增强ccRCC 的增殖和迁移能力。本研究发现，IL4I1 除了可以增强肿瘤细胞的恶性表型外，还可以促进Treg分化、通过影响肿瘤微环境中趋化因子的表达调控Treg 浸润，从而影响ccRCC 的进展，进一步提示IL4I1是一个潜在的ccRCC 治疗靶点，为肾癌的治疗方案提供了新思路。