富脂微环境通过PPARγ/ABCG2 途径促进三阴性乳腺癌细胞的多药耐药

刘俊汝，郁春艳，郑小燕，刘子璇，陈思琦，邓为民

（天津医科大学基础医学院免疫学系，国家教育部免疫微环境与疾病重点实验室，天津 300070）

乳腺癌是最常见的女性癌症类型，也是女性癌症死亡的最常见原因[1]。三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是乳腺癌的一种高度异质性亚型，预后较差[2]。由于缺乏靶向治疗，以紫杉烷或铂类为基础的化疗是三阴性乳腺癌患者的主要治疗方法[3]，但致癌驱动因素的异质性和多药耐药（multidrug resistance，MDR）的发展导致疗效有限[4]。脂肪细胞是TNBC 肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中的主要细胞成分。越来越多的证据表明，肿瘤相关脂肪细胞会加重肿瘤进展，加剧免疫抑制性TME 并影响治疗效果[5]。脂肪细胞产生大量的脂肪因子（包括细胞因子），参与肿瘤的发生、进展和转移[6]。不同的脂肪因子如瘦素、脂联素、白细胞介素－6（IL－6）和肿瘤坏死因子－α 等可通过多种功能机制诱导不同肿瘤细胞的耐药[7]。因此，探寻富脂微环境（adipocyte－rich microenvironment，ARM）促进肿瘤耐药的潜在机制，对提高化疗疗效具有重要意义。本实验利用人脂肪组织提取液（human adipose tissue extracting solution，HATES）模拟ARM[8]，探讨HATES 对TNBC 细胞MDR 的影响及机制。

MDR 是阻碍肿瘤药物成功治疗的一个严重问题。MDR 最突出的机制之一是ATP 结合盒（ABC）转运蛋白的过表达[9]。ABC 转运蛋白通过细胞膜主动泵送多种底物[10]，其中ABC 转运蛋白G 家族成员2（ATP binding cassette subfamily G member 2，ABCG2），又称乳腺癌抵抗蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP），在赋予肿瘤细胞干性表型方面具有潜在作用，并且能够外排抗肿瘤药物，在肿瘤MDR 的发生、发展中发挥重要作用[11]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator activated recep tor gamma，PPARγ）属于类固醇受体超家族的核受体，在脂肪组织的发育和脂代谢中起着重要作用[12]。PPARγ 作为重要的脂代谢调节分子，参与树突状细胞[13]，胎盘绒毛膜癌[14]中ABCG2 的调节。抑制PPARγ可降低ABCG2 介导的M2 巨噬细胞的外排活性[15]。此外，本实验室前期生物信息学数据分析发现，在脂质相关肿瘤上皮性卵巢癌中，PPARγ 是促进化疗耐药的脂相关的关键分子。因此，本研究旨在TNBC细胞中探讨HATES 是否通过PPARγ/ABCG2 途径促进MDR。

1 材料与方法

1.1 材料 人TNBC 细胞MDA－MB－231 由天津医科大学肿瘤医院郭晓静教授惠赠；胎牛血清（FBS）购自GIBCO 公司；DMEM 培养基、CCK－8 检测试剂盒均购自江苏凯基生物技术股份有限公司；紫杉醇（PTX）购自扬子江药业集团有限公司；顺铂（DDP）购自齐鲁制药有限公司；Annexin V－PE/7－AAD 凋亡试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；荧光素酶报告基因试剂盒购自Promega 公司；PPARγ激动剂曲格列酮Trog、PPARγ 拮抗剂GW9662 均购自Selleck 公司；ABCG2 抑制剂KO143 购自MCE公司；人PPARγ 抗体购自Abcam 公司；ABCG2 抗体购自江苏凯基生物技术股份有限公司；GAPDH抗体购自CST 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 MDA－MB－231 细胞以含10%FBS 的DMEM 培养基，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养，每2～3 天更换培养液并消化传代。

1.2.2 人脂肪组织提取液HATES 制备 参考Nie等[16]的方法制备HATES，即乳腺癌患者的肿瘤邻近脂肪组织在术后1 h 内全程无菌送至实验室，用含1×青链霉素混合液的Hanks 缓冲液清洗脂肪组织并剔除筋膜及血块，进行称重，将脂肪组织剪切成2 mm 左右的小块，200 目滤网研磨，按0．8 g 脂肪/mL DMEM 的标准加入适量含1×青链霉素混合液的DMEM，收集全部滤液，1 000 g/10 min 离心。0．22 μmol/L 的过滤器收集后分装冻存备用。使用时应用20% FBS 1∶1 稀释，终浓度为0．4 g 脂肪/mL。

1.2.3 CCK－8 检测细胞增殖 将对数生长期的MDA－MB－231 细胞以7×103/孔密度接种于96 孔板，待细胞贴壁后，按分组处理细胞：（1）不同浓度的GW9662 及曲格列酮（0、5、10、20、40、60 μmol/L）及不同浓度的KO143（0、1、5、10、20、50 μmol/L）处理24 h。（2）GW9662（25 μmol/L）、曲格列酮（25 μmol/L）及KO143（10 μmol/L）处理不同时间（0、2、6、8、12、24 h）。（3）GW9662（25 μmol/L）、KO143（10 μmol/L）预处理2 h；HATES（0．4 g/mL）、DDP（30 μmol/L）、PTX（7 nmol/L）等处理48 h。每组设置3 个复孔。细胞培养结束前30 min，观察每组细胞形态变化，并拍照记录。按CCK－8 检测试剂盒说明书孵育细胞，酶标仪检测450 nm 处的吸光度值（OD450），利用GraphPad prism 9 进行统计学分析。

1.2.4 油红O 染色检测HATES 对MDA-MB-231细胞脂肪酸摄取的情况 将MDA-MB-231 细胞接种于24 孔板，密度为1×105/mL，细胞贴壁后处理不同浓度的HATES（0、0.2、0.4、0.8 g/mL）培养24 h。培养结束后，按照油红O 检测试剂盒说明书进行操作，显微镜下拍照分析。

1.2.5 流式Annexin V-PE/7-AAD 双染凋亡检测HATES、DDP、PTX 对细胞生长、增殖、凋亡的影响 将对数生长期的MDA-MB-231 细胞以2.5×105/孔密度接种于12 孔板，待细胞贴壁后，按分组处理细胞。培养结束后用0.25 %胰酶（不含EDTA）消化收集细胞，加入含2% FBS 的Hanks 洗涤2 次。弃去上清，每管加入100 μL 试剂盒中的1×Annexin V Binding Buffer 重悬细胞，实验组先加入5 μL 的Annexin V 溶液，再加入5 μL 的7-AAD 溶液，混匀，4℃避光染色20 min。细胞通过400 目筛网过滤成单细胞悬液备检。用流式细胞仪进行检测，用空白管和单染管调节电压和荧光补偿，利用FlowJo 软件进行数据分析。

1.2.6 Western 印迹检测HATES 对该细胞PPARγ及ABCG2 蛋白表达 将对数生长期的MDA-MB-231 细胞以5×105/孔密度接种于6 孔板，待细胞贴壁后，根据实验要求按分组处理细胞，将RIPA、蛋白酶抑制剂以1 000∶1 配置裂解液，提取细胞总蛋白。BCA 蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度，配置10%的分离胶，将40 μg/孔的蛋白用10% SDS-PAGE 进行电泳分离。电泳后将蛋白转印于PVDF 膜，100 V转膜1 h，用3%牛血清白蛋白（BSA）室温封闭2 h后，加入特异性一抗，4℃孵育过夜。加入HRP 标记的二抗室温孵育2 h。TBST 清洗后化学发光底物检测试剂盒进行检测。将目的蛋白与内参的灰度比值作为蛋白的相对表达丰度。

1.2.7 小干扰RNA（siRNA）的合成和转染 PPARsiRNA 和阴性对照-siRNA 由中国吉凯公司基因合成和构建。将对数生长期的MDA-MB-231 细胞以1×105/孔密度接种于24 孔板。待细胞贴壁后，按照Lipofectamine 3000 说明书转染siRNA 至细胞中培养72 h。培养结束后Western 印迹验证转染效果。

1.2.8 荧光素酶报告基因检测HATES、GW9662、曲格列酮对MDA-MB-231 细胞ABCG2 转录活性的影响 委托中国吉凯基因公司构建ABCG2-promoter-Luc 质粒及空载体GV238-Luc 质粒和β-gal质粒备用。将对数生长期的MDA-MB-231 细胞以2×105/孔密度接种于24 孔板中。待细胞贴壁后，按照Lipofectamine 3000 说明书转染质粒至细胞中。转染6 h 后将培基更换至含不同处理因素的常规培基进行培养48 h，其中曲格列酮浓度25 μmol/L。培养结束后，按照Promega“荧光素酶报告基因试剂盒”说明书裂解细胞，避光加入100 μL 荧光素酶底物，用Promega 荧光素酶标仪检测ABCG2-promoter Luciferase 的活性。同时吸取20 μL 裂解上清，避光加入80 μL ONPG，37℃孵育30 min 后，检测β-gal活性。Luciferase 的相对活性为Luciferase 的活性与β-gal 活性的比值，GraphPad prism 9 统计并作图。

1.2.9 统计学处理 采用GraphPad prism 9 软件进行统计学分析和作图。正态分布的计量资料使用±s 表示，多组间相互比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PPARγ 拮抗剂GW9662 及激动剂曲格列酮与ABCG2 抑制剂KO143 对MDA-MB-231 细胞的剂量和时间效应 本研究侧重探讨ARM 对肿瘤细胞的效应，首先确定GW9662、曲格列酮及KO143 等试剂的最适浓度和时间，CCK-8 实验结果显示，GW9662、曲格列酮及KO143 对细胞作用24 h 的IC50 分别为26.91、26.57、13.57 μmol/L。根据IC50结果选取25 μmol/L GW9662、25 μmol/L 曲格列酮与10 μmol/L KO143 进行时间效应实验。如图1B结果显示25 μmol/L GW9662、25 μmol/L 曲格列酮与10 μmol/L KO143 处理2 h 均不影响细胞增殖（均P＞0.05）。结合预期结果，选取25 μmol/L GW9662、25 μmol/L 曲格列酮与10 μmol/L ABCG2 预处理细胞2 h，在不影响细胞增殖的情况下进行后续实验（图1）。

图1 GW9662、曲格列酮与KO143 对MDA-MB-231 细胞增殖的剂量和时间效应Fig 1 Dose and time effects of GW9662，Trog and KO143 on the proliferation of MDA-MB-231 cells

2.2 HATES 促进MDA-MB-231 细胞脂滴的积累如图2 结果显示，0.4 g/mL HATES 和0.8 g/mL HATES 均显著促进细胞脂滴的积累，但与对照组相比0.8 g/mL HATES 处理组，细胞形态明显改变，皱缩变圆。结合细胞状态最终选择0.4 g/mL HATES进行后续实验。

图2 HATES 促进MDA-MB-231 细胞脂滴的积累Fig 2 The accumulation of lipid droplets in MDA-MB-231 cells promoted by HATES

2.3 HATES 促进MDA-MB-231 细胞MDR 结果显示，与对照组相比，HATES 浓度未影响细胞生长、增殖及凋亡（均P＞0.05，图3A、3B、3C）。如图3B CCK-8 结果显示，与对照组相比，DDP 组和PTX 组细胞增殖显著降低（t=7.95、16.11，均P＜0.000 1）。与单独DDP 相比，DDP+HATES 组细胞增殖明显增强（t=3.76，P＜0.05）；PTX+HATES 组与之类似（t=8.54，P＜0.01）。如图3C、3D 流式凋亡检测结果显示，与对照组相比，DDP 和PTX 组大量细胞凋亡（t=33.62、34.90，均P＜0.000 1）；与单独DDP 组相比，DDP+HATES 组细胞凋亡显著降低（t=19.68，P＜0.000 1）；PTX+HATES 组与之类似（t=29.24，P＜0.000 1）。细胞的增殖和凋亡与形态图趋势一致。

图3 HATES 促进MDA-MB-231 细胞MDRFig 3 MDA-MB-231 cell MDR promoted by HATES

2.4 HATES 通过调节PPARγ 上调ABCG2 表达 本课题组前期生物信息学分析数据表明，PPARγ 是促进化疗耐药的脂相关的关键分子，ABCG2 是其下游重要靶基因之一。为了确定HATES 是否通过PPARγ 促进ABCG2 的转录，进行荧光素酶报告基因检测（图4A、4B）。结果显示，与空载体组相比，PPARγ 拮抗剂GW9662 显著降低ABCG2 的转录活性（t=18.45，P＜0.000 1），曲格列酮可显著提高ABCG2 的转录活性（t=29.01，P＜0.000 1）。HATES 组ABCG2 的转录活性显著增强（t=4.69，P＜0.01）。与HATES 组相比，HATES+GW9662 组ABCG2 的转录活性显著降低（t=5.39，P＜0.001），HATES+曲格列酮组ABCG2 的转录活性显著增强（t=8.18，P＜0.000 1）。此外，Western 印迹结果显示HATES 处理促进细胞PPARγ 和ABCG2 蛋白表达，而GW9662 降低了HATES 的促进作用（图4C、4D）。

图4 HATES 通过调节PPARγ 上调ABCG2 表达Fig 4 HATES upregulated ABCG2 expression by regulating PPARγ

2.5 HATES 通过PPARγ/ABCG2 途径内源性促进MDA-MB-231 细胞MDR 如图5A Western 印迹结果显示，沉默PPARγ 不仅降低了ABCG2 的蛋白表达，还减弱了由HATES 引起的PPARγ 和ABCG2 蛋白表达的增强效应。如图5B、5C 结果显示，应用DDP和PTX 时，HATES 促进细胞的增殖，而沉默PPARγ可抑制该效应（t=9.14，P＜0.01；t=12.84，P＜0.001）。同样，如图5D 流式凋亡检测结果所示，应用DDP 和PTX 时，HATES 抑制细胞的凋亡，沉默PPARγ 减弱了此影响（t=4.763、16.25，均P＜0.000 1）。

图5 HATES 通过PPARγ/ABCG2 途径内源性促进MDA-MB-231 细胞MDRFig 5 HATES promoted MDA-MB-231 cell MDR via PPARγ/ABCG2 pathway endogenously

2.6 HATES 通过PPARγ/ABCG2 途径外源性促进MDA-MB-231 细胞MDR 如图6A、6B 结果所示，与DDP+HATES 组相比，DDP+HATES+GW9662 组与DDP+HATES+KO143 组的细胞增殖显著下降（t=3.02、3.41，均P＜0.05）；与PTX+HATES 组相比，PTX+HATES+GW9662 组与PTX+HATES+KO143 组的细胞增殖显著下降（t=4.93、4.59，均P＜0.001）。如图6C显示，与DDP+HATES 组相比，DDP+HATES+GW9662组与DDP+HATES+KO143 组细胞凋亡率显著增高（t=9.06、14.14，均P＜0.000 1）；与PTX+HATES 组相比，PTX+HATES+GW9662 组与PTX+HATES+KO143 组细胞凋亡率显著增高（t=13.72、12.20，均P＜0.000 1）。

3 讨论

TNBC 占所有乳腺癌病例的10%～15%，是最致命的乳腺癌亚型[17]。TNBC 缺乏雌激素（ER）和孕激素受体（PR），表达低水平的人表皮生长因子受体2（HER2），因此对激素或抗HER2 治疗无反应[18]。因其具有高异质性，侵袭性和缺乏治疗选择，化疗仍然是TNBC 的标准疗法，但患者经常产生耐药性[19]。脂肪细胞在构成乳腺组织的细胞中占最大比例，被认为是乳腺癌肿瘤微环境中的关键细胞类型[20]。脂肪细胞来源的条件培养基有助于乳腺癌、胰腺导管癌和人类黑色素瘤对化疗和靶向治疗的抵抗[21]。因此迫切需要探究ARM 对TNBC 化疗耐药的影响，以确定新的靶点来减弱或逆转化疗耐药。本研究通过HATES 模拟ARM，发现其在化疗药物存在情况下促进TNBC 细胞增殖并减少细胞凋亡，证实HATES促进TNBC 细胞的MDR。

肿瘤细胞中的MDR 与许多机制有关，包括DNA修复和损伤，药物代谢改变，抑制细胞凋亡和外排转运蛋白的过表达等[22]。ABCG2 可有效的将广谱化疗药物排出肿瘤细胞，引起临床MDR[23]。因此，发现有效的调节剂以规避ABCG2 介导肿瘤的MDR 非常重要。PPARγ 主要在脂肪组织、造血细胞和大肠中表达[12]。脂肪酸是PPARγ 的天然激动剂。一项关于人脑树突状细胞研究显示PPARγ 是ABCG2 新的调节剂[13]。此外，在胎盘滋养层细胞中使用PPARγ激动剂显著促进了ABCG2 的表达[14]。本研究荧光素酶报告基因结果表示HATES 通过PPARγ 提高ABCG2 的转录活性。

在各种富含脂肪细胞的相关肿瘤中，脂肪细胞在肿瘤进展中起着至关重要的作用。脂肪细胞-卵巢癌细胞共培养导致脂质从脂肪细胞直接转移到卵巢癌细胞，并促进体外和体内肿瘤细胞生长[24]。同时脂肪细胞通过脂肪酸转运蛋白（FATPs）推动黑色素瘤的进展[25]。本实验主要关注HATES 通过PPARγ/ABCG2 影响TNBC 细胞耐药，因此实验中HATES 调整为不影响肿瘤细胞增殖、凋亡的浓度，以排除其影响耐药造成的干扰。在膀胱癌中，GW9662 及曲格列酮处理48~96 h 均对细胞增殖有影响[26]，本实验通过探索GW9662、曲格列酮及KO143 的使用浓度及处理时间，结合细胞活性及状态选择GW9662、曲格列酮及KO143 预处理细胞2 h[27-28]，在药物本身不改变肿瘤细胞增殖和凋亡以避免干扰的情况下，探讨HATES 是否通过PPARγ/ABCG2 途径参与MDR。在乳腺癌中，肿瘤细胞自分泌产生的脂肪因子IL-6 可以上调ABCG2的表达，从而促进MDR 水平[7]。在本实验中，HATES通过PPARγ/ABCG2 途径促进TNBC 细胞的MDR，但由于HATES 成分复杂，且本研究中获取HATES需进行研磨和过滤等操作，会损失一部分发挥作用的效应因子，因此后续将应用脂质组学分析检测HATES 中起主要作用的脂质代谢物，以及细胞因子芯片分析HATES 中发挥主要作用的脂肪因子。

综上所述，本研究通过体外实验证实HATES 通过PPARγ/ABCG2 途径促进TNBC 细胞的MDR，对临床干预TNBC 提供潜在的治疗靶点具有指导意义。