东北野生榛子叶中鞣质成分的提取工艺研究

王硕，卢慧，车环宇*

（1.通化师范学院医药学院，通化 134002；2.通化医药健康职业学院，通化 134002）

榛子，又称山板栗，主要含有鞣质、挥发油、有机酸、黄酮等成分，其中鞣质含量尤为丰富，而榛子叶中含量最高。鞣质具有抑制细菌、抵抗病毒、抗诱变、抗过敏等生物活性，在医药、化妆品、食品等工业中被广泛应用[1]。榛子叶廉价易得，对其进行研究开发具有重要意义。

1 实验材料、仪器与方法

1.1 实验材料

榛子叶采于黑龙江省哈尔滨市郊帽儿山；丙酮为分析纯；对照品：没食子酸、磷酸、磷酸二氢钾均为分析纯；甲醇、乙醇、乙酸乙酯均为色谱纯；重蒸馏水。

1.2 实验仪器

超声波振荡提取器；旋转蒸发仪 N-1000；HPLC；水浴锅 SB-200；AL 系列溶剂过滤器；循环水真空泵SHB-95；中草药粉碎机。

1.3 实验方法

实验采用丙酮-水体系，进行正交试验，最佳工艺确定为 1∶12 g·mL-1的 70%丙酮，在 100KHz 超声频率下超声提取 60min。

高效液相色谱法测定榛子叶中没食子酸含量，没食子酸标准品在 λ=280nm 条件下检测，在 0.08～6.48μg 范围内呈良好的线性关系，回归方程为 y=2523.6x-28.652，r=0.9999。榛子叶中总鞣质、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物没食子酸的含量分别为0.99%、3.94%、0.14%(n=6)。

2 方法与结果

2.1 榛子叶鞣质提取分离

多酚类化合物具有多个酚羟基和游离羟基，极性较强。传统方法提取植物多酚，常用水和乙醇作为提取溶剂，提取效率低，溶剂用量大，一些极性较小的成分难以被完全提取。由于鞣质在酸、碱、高温等条件下不稳定，报道提取方法的文献不多。榛子叶中药理活性成分较多，不同的提取工艺直接影响其药效。超声的选择性高、穿透力强，超声技术能极大的加快反应速度，减少反应时间，应用于植物细胞破壁时，可以有效增加收率。因为丙酮-水对鞣质的提取率高，而且减压蒸发很容易将丙酮从提取液中去除，剩下鞣质的水溶液，所以，采用丙酮-水体系进行超声提取。总鞣质的提取一般用 Me2CO-H2O (5∶5～7∶3)。本实验选用70%丙酮为溶剂，对榛子叶中的总鞣质进行提取分离。通过 HPLC 法以没食子酸含量为指标，对 9 种不同提取工艺提取的榛子叶鞣质含量进行测定，拟选出提取榛子叶中鞣质的最佳工艺。

2.1.1 提取分离

采用不同溶剂用量、不同超声时间和不同超声频率提取榛子叶中的鞣质成分，用高效液相法测定榛子叶中总鞣质含量，从而确定最佳提取工艺。

2.1.2 正交优化实验

因素水平设置为料液比 (A)、超声时间 (B)、超声频率 (C)。由于鞣质对热的不稳定性，故选择提取温度为室温。以上三个因素各设置三个水平，因素水平安排见表1。

表1 因素和水平表

2.1.3 实验结果

分别取 9 份 10g 的榛子叶，以丙酮提取榛子叶总鞣质含量作为考察指标，按照 L9(33)正交表条件进行实验，用 HPLC 色谱法以没食子酸为标准对照品，测定各实验总鞣质中没食子酸含量，结果表2。

表2 L9(33)正交表及实验结果

经方差分析得优化结果，详见表3。

表3 正交实验方差分析

分析结果表明，B 因素的水平变化对实验结果无显著影响；A、C 因素的水平变化对实验结果具有较显著影响。所以提取工艺的最佳条件为 A3B2C3，即在 100KHz超声频率下用液料比为 1∶12 g·mL-1的 70%丙酮超声提取 60min，得到榛子叶总鞣质含量为 0.99%(n=6)。

2.2 HPLC 法测定榛子叶总鞣质及不同萃取部位中没食子酸的含量

没食子酸是可水解鞣质后的产物，在各种可水解鞣质的提取过程中均可得到。目前，《中国药典》采用紫外分光光度法以没食子酸为对照来测定鞣质的含量。因此，采用 HPLC 色谱法测定没食子酸含量，从而对榛子叶鞣质提取物进行初步的确定。

实验仪器：色谱柱，美国迪马公司 C18柱 (4.6mm×200nm，5μm)；检测波长，λ=280nm；流速：1.0mL·min-1；流动相：磷酸 (0.01mol·L-1)-磷酸二氢钾 (0.01mol·L-1)-乙醇-乙酸乙酯 (42.5∶42.5∶10∶5)。

2.2.1 线性关系考察

精密称取没食子酸对照品，甲醇配制浓度分别为0.02、0.06、0.18、0.54、1.62 mg·mL-1的溶液。标准品溶液均为 4μL。依照上述色谱条件进样，测定峰面积。没食子酸在 0.08～6.48μg 范围内呈良好的线性关系(见图1)。绘制标准曲线时，没食子酸进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程：y=2523.6x-28.652，r=0.9999。标准品的 HPLC 标准曲线图谱，详见图2。

图1 线性关系图

图2 标准品没食子酸含量的HPLC 谱图

图3 榛子叶总鞣质没食子酸含量的HPLC 谱图

图4 榛子乙酸乙酯萃取物没食子酸含量的HPLC 谱图

图5 榛子正丁醇萃取物没食子酸含量的HPLC 谱图

2.2.2 精密度实验

精密吸取 0.12mg·mL-14μL 没食子酸对照品溶液，连续进样 6 次，计算出 RSD 值为 1.02%。

2.2.3 重现性实验

分别取榛子叶 6 份，各约 0.6g，按上述提取分离项操作，分别测得榛子叶总鞣质、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物 RSD 值依次为 1.64%、1.35%、1.76%，表明该方法重现性良好。

2.2.4 稳定性实验

分别取榛子叶总鞣质、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物的同一供试品溶液，在 0、4、8、12、24h 各测定一次，进样量 10μL。在 24h 内，榛子叶总鞣质 RSD 值为 1.82%，正丁醇萃取物 RSD 值为 2.28%，乙酸乙酯萃取物 RSD 值为 1.79%，表明三种供试品溶液在 24h内基本稳定。

2.2.5 加样回收率实验

精密称取榛子叶总鞣质、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物各 9 份，均 1.5g。每种待测品平均分成 3 组，分别加入相当于待测品总量 80%、100%、120%的没食子酸，依照上述内容操作，计算回收率。榛子叶总鞣质的平均加样回收率为 97.43%，RSD 值为 1.86%；乙酸乙酯萃取物的平均加样回收率为 100.73%，RSD 值为 1.24%；正丁醇萃取物平均加样回收率为102.36%，RSD 值为 1.84%。

2.2.6 样品测定

采用提取榛子叶总鞣质的最佳工艺，减压浓缩(40℃)，用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇浓缩液分次萃取，减压回收 (40℃)，浓缩至恒重，分别得到榛子总鞣质、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物三组样品，备用。分别精密称取 0.1mg 干燥的榛子叶总鞣质、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物粉末，放置于 25mL 容量瓶中，加入甲醇溶解。榛子叶总鞣质、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物的进样量分别为 10μL，按标准曲线法操作，测定色谱峰面积，计算含量。HPLC 图谱见 3、4、5。

3 结果与分析

正交设计试验采用不同溶剂用量、不同超声时间和不同超声频率提取榛子叶中的鞣质成分，再利用HPLC 色谱法对实验所得成分中的没食子酸进行含量测定，从而确定最佳提取工艺。

由表1 和 3 中看出，各因素下的水平优势为 A3＞A2＞A1、B2＞B3＞B1、C3＞C2＞C1；由 r 值看出实验中各因素对实验结果的重要性依次为 A＞C＞B；最佳工艺条件为 A3B2C3，即用液料比为 1∶12g·mL-1的 70%丙酮，在100KHz 超声频率下提取 60min 得到的榛子叶鞣质成分最多。由方差分析得出 B 因素的水平变化对实验结果无显著影响；A、C 因素的水平变化对实验结果具有较显著影响。

料液比 1∶12g·mL-1的 70%丙酮在 100KHz 超声频率下提取 60min，抽滤，减压回收丙酮后，用氯仿萃取，除去叶绿素，再用乙酸乙酯、正丁醇萃取，干燥后得到榛子叶总鞣质、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。用 HPLC 法进行样品测定，结果得出榛子叶总鞣质中没食子酸的平均含量 0.99%，RSD=1.04%(n=6)；乙酸乙酯萃取物中没食子酸的平均含量 3.94%，RSD=1.51%(n=6)；正丁醇萃取物中没食子酸的平均含量为 0.14%，RSD=0.97%(n=6)。由结果看出榛子叶总鞣质、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物中所含没食子酸成分的含量为乙酸乙酯萃取物最高，需在抗氧化实验中进一步确定各组分的鞣质含量。

4 结论

榛子叶的鞣质含量丰富，为了更好的开发利用，围绕榛子叶鞣质的提取分离、抗氧化作用及其作用机制为目的进行实验研究。首先，采用正交实验法筛选出超声提取榛子叶中鞣质的最佳工艺，再通过 HPLC法测定榛子叶总鞣质、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物中没食子酸的含量。

正交设计试验以料液比、超声时间和超声频率为考察因素，提取榛子叶中的鞣质成分，再利用 HPLC色谱法对实验所得成分中的没食子酸进行含量测定，从而确定最佳提取工艺为：料液比 1∶12g·mL-1的 70%丙酮在 100KHz 超声频率下提取 60min。由方差分析得出料液比、超声频率的水平变化对实验结果具有显著影响。