坤宝丸HPLC 指纹图谱的建立

张浩，叶静，高尚，王屾，王海艳，丛鑫，田淑琳

（1.辽宁盘锦检验检测中心，盘锦 124010；2.盘山县疾病预防控制中心，盘山 124100）

坤宝丸是由酒女贞子、白芍、黄芩等 23 味中药制成的成方制剂，为原料药材粉碎混匀后加水和炼蜜制成的水蜜丸，具有滋补肝肾，养血安神功效，用于肝肾阴虚所致绝经前后诸证，临床上对妇女绝经前后及更年期综合征有较好的疗效[1-4]。《中国药典》2020 年版一部收载的坤宝丸质量标准中薄层色谱鉴别和芍药苷含量测定项[1]，不能全面地反映制剂质量，难以对坤宝丸的质量进行整体控制。因此本文建立坤宝丸HPLC 指纹图谱，进一步完善坤宝丸的质量控制方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；BP211D 电子天平（德国 Sartorius 公司）；KQ3200DB型超声波清洗器（江西赣仪科技有限公司）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；0.45μm 滤膜（天津津腾实验设备有限公司）。

1.2 试药

芍药苷对照品（批号：110736-202246，纯度为96.7%）、黄芩苷对照品（批号：110715-202223，纯度为97.2%）均购于中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯，美国 Fisher 公司）；乙醇（95%）为分析纯；磷酸为优级纯；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

本研究应用 HPLC 指纹图谱分析的 15 批坤宝丸样品由一家生产企业提供。选取该企业不同批号的坤宝丸样品进行 HPLC 指纹图谱分析研究，样品来源信息，详见表1。

表1 样品来源信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Diamonsil Plus C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱，0～20min，5%～35%A；20～36min，35%～45%A；36～45min，45%～55%A；45～60min，55%～80%A；60～65min，80%～5%A；体积流量 1.0mL/min；柱温 35℃；检测波长254nm；进样量 10μL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取芍药苷、黄芩苷对照品适量，用乙醇（95%）溶解并稀释，制成对照品贮备液；分别精密吸取上述对照品贮备液适量，用乙醇（95%）稀释，即得含芍药苷 47.72μg/mL、黄芩苷 54.09μg/mL 的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取坤宝丸，粉碎后过 5 号筛，精密称取粉末 0.5g，置于具塞锥形瓶中，精密加入 25mL 乙醇（95%），称定，超声处理（功率 500 W，频率 40 kHz）30min，放冷，再称定，用乙醇（95%）补足，摇匀后微孔滤膜滤过，即得。

2.4 指纹图谱方法学考察

2.4.1 专属性试验

按 “2.1”项下色谱条件，取空白试剂乙醇（95%）、供试品溶液分别进样分析，记录色谱图。空白试剂对供试品溶液的测定不存在干扰，表明专属性良好。

2.4.2 精密度试验

取坤宝丸供试品（S10），按 “2.3”项下方法制备供试品溶液，按 “2.1”项下色谱条件连续进样 6 次，记录色谱图。参照峰（S）为 4 号芍药苷，通过计算，各共有峰相对保留时间的 RSD 均 ≤0.36%，相对峰面积的RSD 均 ≤1.87%，表明仪器的精密度良好。

2.4.3 重复性试验

取坤宝丸供试品（S10），按 “2.3”项下方法平行制备 6 份供试品溶液，按 “2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。参照峰（S）为 4 号芍药苷，通过计算，得各共有峰相对保留时间的 RSD 均 ≤0.16%，相对峰面积的 RSD 均 ≤2.16%，表明该方法重复性良好。

2.4.4 稳定性试验

取坤宝丸供试品（S10），按 “2.3”项下方法制备供试品溶液，按 “2.1”项下色谱条件，分别在 0、3、6、9、18、24h 进样测定，记录色谱图。参照峰（S）为 4 号芍药苷，通过计算，得各共有峰相对保留时间的 RSD均 ≤0.31%，相对峰面积的 RSD 均 ≤2.35%，表明供试品溶液在 24h 内稳定性良好。

2.5 指纹图谱的建立及相似度评价

分别取 15 批坤宝丸样品，按 “2.3”项下方法制备供试品溶液，按 “2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。采用 《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版，以 S1 图谱为参照图谱，采用平均数法，时间窗宽度设定为 0.1，进行色谱峰匹配，建立共有模式，获得15 批坤宝丸 HPLC 指纹图谱（S1～S15）及对照图谱（R）（图1），标记 16 个共有峰。以生成的对照图谱为参照，15 批坤宝丸样品的相似度分别为 S1（0.975）、S2（0.978）、S3（0.976）、S4（0.972）、S5（0.979）、S6（0.976）、S7（0.977）、S8（0.985）、S9（0.983）、S10（0.987）、S11（0.980）、S12（0.982）、S13（0.989）、S14（0.981）、S15（0.978），相似度良好，可以知道各批坤宝丸样品的质量比较稳定。

2.6 色谱峰的指认

15 批坤宝丸样品的 HPLC 指纹图谱中，共标定出 16 个共有峰，通过与对照品比对指认出 2 个色谱峰，分别是芍药苷（4 号峰）、黄芩苷（10 号峰），供试品溶液（图2）和对照品溶液（图3）。

图2 供试品溶液色谱图

图3 对照品溶液色谱图

3 讨论

中药指纹图谱技术因操作简单、准确可靠，又能表征中药的整体信息和内容，目前在中药质量控制和评价领域中得到广泛应用和认可[5-15]。本文通过建立坤宝丸 HPLC 指纹图谱，以芍药苷色谱峰作为参照峰，对 15 批样品进行了相似度评价，结果表明各批坤宝丸质量比较稳定。通过应用该方法，体现中药成方制剂的内在质量和制备工艺流程的整体差异性，利用中药指纹图谱相似度评价结果可以直观分析不同批次间的质量差异。本研究建立的坤宝丸 HPLC 指纹图谱评价方法简便可靠、重复性好，可以作为坤宝丸质量控制的方法。