鹿茸多肽对 TBHP 诱导的 H9c2 心肌细胞凋亡的影响

赵越超，周高峰，周佳，律广富，王雨辰，黄晓巍,3*

（1.长春中医药大学药学院，长春 130117；2.长春中医药大学吉林省人参科学研究院，长春 130117；3.长春中医药大学东北亚中医药研究院，长春 130117）

目前，心血管疾病发病率占我国城乡居民总患病率之首，而且人数仍在不断攀升，已成为重大公共卫生问题[1-2]。研究表明，心血管疾病的发生发展主要基于细胞凋亡、钙超载、心肌细胞坏死、纤维化等病理变化[3]。细胞凋亡（apoptosis）是一种高度调控的程序性细胞死亡形式，细胞形态主要表现为细胞收缩、胞膜气泡及细胞凋亡小体形成[4]。鹿茸为传统名贵药材，是鹿科动物梅花鹿或马鹿的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，具有较高的药用价值和经济价值[5]。鹿茸含有鹿茸多肽、甾体化合物、蛋白质、多糖、无机盐等多种活性成分，其中鹿茸多肽（velvet antler peptide，VAP）作为鹿茸中的主要活性成分，内含多种生物活性因子[6]。具有调节心血管疾病、骨骼疾病、神经系统、免疫系统等功能[7]。有研究显示，VAP 能够调节心肌缺血大鼠心肌细胞线粒体中Bax（Bcl associated X）和 B 细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcelllymphoma-2，Bcl-2）基因的表达，并对细胞凋亡相关蛋白半胱氨酸蛋白酶（Caspase-3）进行检测，证实VAP 可减轻缺血缺氧诱导的心肌细胞凋亡[8-9]。

本研究探讨 VAP 对叔丁基过氧化氢（tert-butyl hydroperoxide，TBHP）诱导的心肌细胞 H9c2 心肌细胞凋亡及心肌 Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表达的影响，以期为 VAP 治疗心血管疾病提供相应的实验依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物、细胞、药物、主要试剂和仪器

SPF 级 Wistar 雄性大鼠 21 只，体质量（180.00±20.00）g（长春市亿斯实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK-（吉）-2020-0002）；药材鹿茸多肽（长春中医药大学药学院制备，每 1 g 约含生药 28.9 g，批号：20201120）；大鼠 H9c2 细胞（中国科学院上海细胞库，批号：3111C0001CCC000219）；胎牛血清 (CLARK Bioscience，货号：FB15015C)；高糖 DMEM 培养基 (Gibco，货号：31053036)；胰蛋白酶-EDTA(0.25%)(Gibco，批号：25200072)；青链霉素 (北京索莱宝科技有限公司，货号：P1400)；叔丁基过氧化氢 (西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，货号：458139)；二甲基亚砜 (北京索莱宝科技有限公司，批号：D8371)；PBS 缓冲液 (北京索莱宝科技有限公司，货号：P1022)；细胞凋亡-Hoechst 染色试剂盒 (上海碧云天生物技术有限公司，货号：C0003)；BCA 蛋白浓度测试试剂盒 (上海碧云天生物技术有限公司，货号：p0012s)；Bax、Bcl-2、Caspase-3 抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，货号：50599-2-Ig、26593-1-AP、19677-1-AP）；多功能微孔板酶标仪 (美国赛默飞世尔有限公司，型号：SUNERGY-HTX)；电泳仪、电泳槽 (美国伯乐 Bio-Rad 公司，型号：BE6085)；多道生理记录仪 (埃德仪器国际贸易有限公司，型号：ML22)；二氧化碳培养箱 (赛默飞世尔科技（中国）有限公司,型号：311)；倒置荧光显微镜(日本奥林巴斯公司，型号：CKX4)。

1.2 VAP 含药血清制备

健康 Wistar 大鼠 21 只，随机分为 3 组，即空白血清组 (Blank serum group)、100 mg·kg-1VAP 低剂量含药血清组 (VAP L group)和 400 mg·kg-1VAP 高剂量含药血清组 (VAP H group)，均灌胃给药，每天 1 次，连续7d。第 7 天灌胃 2 h 后，腹主动脉取血，3000 r·min-1离心 15min，分离血清，0.22μm 微孔滤膜过滤除菌后分装，置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3 细胞培养

大鼠 H9c2 细胞生长于含 10%胎牛血清的 DMEM培养液中，置于 37 ℃、5%CO2饱和湿度的恒温密闭培养箱中进行常规培养并传代，0.25%胰蛋白酶消化，每3 d 消化传代 1 次。

1.4 实验分组

6 孔细胞培养板中培养 24 h 的 H9c2 细胞更换新培养液，然后每 2 孔做不同的药物处理。①空白对照组(Blank control group)；②空白血清组(Blank serum group)；③TBHP 组(TBHP group)；④VAP 低剂量组(TBHP+VAP L group)；⑤VAP 高剂量组 (TBHP+VAP H group)，除空白对照组和 TBHP 组外，其余各组给予20%VAP 含药血清。

1.5 MTT 法检测各组细胞存活率

在无 FBS 的 DMEM 中配制浓度分别为 400、200、100 和 50 μmol·L-1的 TBHP。将 5×103细胞接种于 96孔细胞培养板，分别培养 24、36 和 48 h 后，每孔加入20 μL MTT，37℃孵育 4 h；弃液，加入 150 μL DMSO，酶标仪检测 490 nm 波长处吸光度 (A)值。细胞存活率=实验组 A 值/对照组 A 值 ×100%。根据结果选择 TBHP最佳造模浓度为 200 μmol·L-1，时间为 24 h，检测各组细胞存活率。

1.6 Hoechst 染色法检测各组细胞凋亡情况

将 H9c2 细胞接种于 6 孔细胞培养板（每孔 6×104个细胞）中培养 24 h。清洗，固定细胞，染色，具体步骤参照试剂盒说明书。

1.7 Western blotting 法检测各组细胞中 Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表达水平

将细胞接种于 6 孔细胞培养板（每孔 6×104个细胞）中培养 24 h。细胞分组和处理见 “1.4”。收集细胞，按照总蛋白提取试剂盒说明书提取各组总蛋白，采用BCA 定量，每孔上样 20 μL 蛋白，进行凝胶电泳，90 min 后转膜至 PVDF 膜上，奶粉封闭液封闭 1h，加入兔抗 GAPDH、Bax、Bcl-2、Caspase-3 一抗，4 ℃孵育过夜。次日加入抗兔二抗，并在室温摇床孵育 2 h，按照高敏感度化学发光检测试剂盒说明书滴加发光工作液显色后，以 GAPDH 为内参，采用 Imageproplus 6.0 软件进行灰度分析。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/GAPDH 条带灰度值。

1.8 统计学分析

采用 SPSS21.0 统计软件进行统计学分析。计量资料均采用表示，组间比较采用单因素方差分析，显著性水准 P＜0.05。

2 结果

2.1 各组细胞存活率

与空白对照组比较，TBHP 处理可以显著降低细胞存活率（P＜0.05）；与 TBHP 组比较，VAP 高和低剂量组的细胞存活率显著升高 (P＜0.01)。与 5%和 10%VAP含药血清浓度比较，20%VAP 含药血清给药后的细胞存活率升高，故选取 20%含药血清浓度。详见表1。

表1 各组H9c2 细胞存活率（n=6）

2.2 各组细胞凋亡情况

与对照组比较，TBHP 处理组活细胞降低；与TBHP 组比较，VAP 高和低剂量组的活细胞升高。详见图1。

图1 各组H9c2 细胞凋亡情况

2.3 各组细胞中 Bax、Bcl-2、Caspase-3 的蛋白水平

与空白对照组比较，TBHP 组的 Bax、Caspase-3 的蛋白水平明显升高、Bcl-2 蛋白水平降低、Bcl-2/Bax 值显著降低（P＜0.01）；与 TBHP 组比较，VAP 高、低剂量组的 Bax、Caspase-3 的蛋白水平明显降低、Bcl-2 蛋白水平升高、Bcl-2/Bax 值显著升高（P＜0.01）。详见表2，图2。

图2 各组细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3 表达水平电泳图（n=3,）

表2 各组细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表达水平（n=3）

3 讨论

H9c2 心肌细胞经 TBHP 诱导后出现明显损伤，TBHP 作为外源性氧化应激反应的诱导剂，通过亚铁离子等金属反应，导致生成过量 ROS，产生丙二醛（Malondialdehyde，MDA），诱导细胞凋亡[10-11]。早期细胞凋亡会导致线粒体膜电位变化[12]。研究发现，鹿茸多肽可通过增强线粒体膜电位的稳定性，减少细胞凋亡[13]。Caspase-3 作为细胞凋亡发生的标志酶，会引起蛋白的失活和切割效应[14]。鹿茸多肽具有神经修复作用，可抑制 Caspase-3 的表达，抗凋亡蛋白 Bcl-2 与促凋亡蛋白 Bax 特异性结合作用于细胞内，Bcl-2/Bax 增加抑制细胞凋亡，反之则促使细胞凋亡[15]。鹿茸多肽改善细胞凋亡的机制与调节 Bcl-2 蛋白家族群的表达有关。

本研究进行体外细胞实验发现，通过 TBHP 诱导的 H9c2 大鼠心肌细胞内 Bax、Caspase-3 的蛋白水平明显升高、Bcl-2 蛋白水平降低，Bcl-2/Bax 值显著降低。应用鹿茸多肽后，各剂量组的蛋白表达水平均有所改善。说明鹿茸多肽在一定程度上可抑制 Bax、Caspase-3 表达，提高 Bcl-2 蛋白水平，减少心肌细胞凋亡。结果表明，鹿茸多肽可明显保护 TBHP 诱导的心肌细胞凋亡模型，提示其药理作用机制可能与调控受损细胞内相关蛋白活性有关，可为其他中药研究提供相关理论参考。