酸浆宿萼中花色苷提取工艺优化及体外降糖活性

陈建宇，石朔，苏连玉，步春红，李成华

（1.通化师范学院吉林省重点实验室-长白山植物种质资源保护与利用实验室，通化 134002；2.通化金汇药业股份有限公司，通化 134002）

酸浆 (Physalis alkekengi L.)别名红姑娘，全株均可入药[1]，民间常用酸浆宿萼降低糖尿病患者血糖，效果明显。

花色苷是广泛存在于植物许多部位的重要水溶性色素[2]，赋予植物不同器官黑、紫红、黄等色彩[3]，属于类黄酮化合物，有抗氧化、抗糖尿病、抗菌等多种功能[4]。吴莹[5]研究发现，黑豆皮花色苷能抑制 α-淀粉酶；蓝莓花色苷、黑加仑花色苷能抑制 α-葡萄糖苷酶，效果比阿卡波糖好。郭晓宇[6]等从体外降糖实验得出红米中的花色苷有一定的降糖活性。张静[7]等研究发现黑果枸杞花色苷能够可逆性竞争性抑制胰脂肪酶活性。李晓娇等[8]研究发现粗梗稠李花色苷能够显著抑制大肠杆菌等细菌的活性，具有明显的抗氧化作用。

提取花色苷经常使用的溶剂有甲醇、乙醇、酸化乙醇和酸化水[9]。花色苷在常见提取剂甲醇和乙醇中都有令人满意的提取效果，常选取酸性甲醇或酸性乙醇当作提取剂，通过振荡、超声辅助提升提取率。然而，食品行业在选择提取溶剂时，不能只考虑花色苷的提取率，更应该考虑提取成本和安全性。酸化乙醇提取溶剂具有安全、高效的优点，是提取花色苷常用的溶剂。出于安全考虑，本文选取柠檬酸酸化的乙醇提取花色苷。超声波辅助提取属于绿色提取工艺，能够减少有机溶剂的用量、节约能量消耗、缩短提取时间，超声波能够促使细胞壁破裂、细胞膜变形破裂，使细胞内花色苷更加容易释放。相比其他提取方法，超声波提取法对于花色苷的提取有非常好效果[10]。

合成色素易引发中毒、腹泻等危害人体健康的副作用，因此天然水溶性色素花色苷的研究越来越引起人们的关注。本文以酸浆宿萼为试材，柠檬酸酸化的乙醇为提取溶剂，研究超声波辅助提取酸浆宿萼花色苷工艺条件，通过对 α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制能力评价花色苷体外降糖活性，为酸浆活性成分的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试酸浆宿萼于 2020 年采自通化县西江镇，烘干粉碎备用。

酶标仪（Bio-Rad 公司）；UV1900 紫外-可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司制造）；RE-52AA旋转蒸发器 (上海亚荣)。

α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、PBS 溶液购自上海伊卡生物技术有限公司；无水乙醇、柠檬酸等均为分析纯，购于天津市百世化工有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酸浆宿萼中花色苷的提取工艺

参照周新宇[11]等的实验方法提取花色苷，具体如下：

酸浆宿萼粉末 →加入柠檬酸酸化的乙醇溶液→pH 值调为 2→超声提取 2 次 →定容至 25mL→酸浆宿萼花色苷提取物

1.2.2 最大吸收波长的确定

称取酸浆宿萼粉末 1g，按 1.2.1 方法得 25mL 酸浆宿萼花色苷提取物，于 200～700nm[12]处进行全波长扫描，测定酸浆宿萼中花色苷的最大吸收波长为534nm。

1.2.3 单因素实验

称取酸浆宿萼粉末 1g，料液比 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25g/mL，超声温度 20、30、40、50、60℃，乙醇体积分数 20%、40%、60%、80%、100%，超声时间 10、20、30、40、50 min 这 4 个因素对酸浆宿萼花色苷提取量的影响。

1.2.4 响应面法优化提取条件

利用 Design-Expert 8.0.6 软件，参考罗磊[13]等的实验方法优化提取酸浆宿萼花色苷条件，进行试验设计[14]，详见表1。

表1 因素水平设计表

1.2.5 花色苷含量的测定

采用 pH 示差法[15]结合比尔定律[16]计算酸浆宿萼花色苷的含量。

式中 Y 为酸浆宿萼中花色苷含量（mg.g-1），ΔA 为吸光度 ApH1.0 和 ApH4.5 的差值，V 为提取液总体积（L），n 为稀释倍数，M 为矢车菊-3-葡萄糖苷的摩尔质量（449g.mol-1），ε 为矢车菊-3-葡萄糖苷消光系数 [26900L.(mol.cm)-1]，m 为样品质量（g）。

1.2.6 降糖活性测定

制备 0.067、0.133、0.266、0.532、1.063 mg/mL 的酸浆宿萼花色苷样品溶液，0.0625、0.125、0.25、0.5、1mg/mL 的阿卡波糖阳性对照溶液。

1.2.6.1 对 α-葡萄糖苷酶的抑制能力测定

α-葡萄糖苷酶的抑制：磷酸盐缓冲溶液 +α-葡萄糖苷酶 +样品（37℃烘箱中 15min）+PNPG（37℃烘箱中 15min）+碳酸钠，终止反应，540nm 处测吸光度。详见表2。

表2 α-葡萄糖苷酶的抑制表

1.2.6.2 对 α-淀粉酶的抑制能力测定

DNS 溶液制备：参照沈鹏[17]等的实验方法制备DNS 溶液。

α-淀粉酶的抑制：样品 +α-淀粉酶（37℃水浴锅中 10min）+淀粉溶液 +DNS 溶液，540 nm 波长处测定吸光度值。详见表3。

表3 α-淀粉酶的抑制表

α-淀粉酶的抑制率=[（B对照-B空白对照）-(B样品-B样品对照) ]/（B对照-B空白对照）×100%，求 IC50值。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对酸浆宿萼花色苷提取量的影响

由图1 可知，酸浆宿萼花色苷的吸光度值从料液比 1∶10 g·mL-1开始随料液比的增大而增大，料液比1∶20 g·mL-1的时候花色苷吸光度值达到最高峰，随后开始下降，因此选择料液比在 1∶20 g·mL-1时较适宜。这可能与随着溶液体积增大非花色苷可溶性物质溶解度增大有关[18]。

图1 料液比对花色苷含量的影响

2.1.2 乙醇体积分数对酸浆宿萼花色苷提取量的影响

由图2 可知，当乙醇体积分数为 55%的时候花色苷吸光度值达到峰值。花色苷是由苷元和糖基组成，乙醇体积分数为 55%时表现出来的极性与酸浆宿萼中花色苷的极性较为接近[19]，更有利于酸浆宿萼花色苷的溶出。因此乙醇体积分数在 55 %时较适宜。

图2 乙醇体积分数对花色苷含量的影响

2.1.3 超声温度对酸浆宿萼花色苷提取量的影响

由图3 可知，超声温度为 50 ℃的时候花色苷吸光度值达到峰值。花色苷耐热性差，在高温和超声波的作用下，会发生结构改变，吸光度值减小[20]。因此超声温度在 50 ℃时较适宜。

图3 提取温度对花色苷含量的影响

2.1.4 超声时间对酸浆宿萼花色苷提取量的影响

由图4 可知，超声时间为 20 min 的时候花色苷吸光度值达到峰值，之后吸光度值变化不大。花色苷在固液 3 之间基本达到平衡[21]。因此超声时间在 20 min 时较适宜。

图4 超声比对花色苷含量的影响

2.2 响应面法优化酸浆宿萼花色苷提取工艺

采用响应面法分析试验，以花色苷提取量为响应值，对试验数据进行二次多项式回归拟合，得回归方程：Y=1.14 +0.034A +0.021B +0.025C +0.037D +7.765AB-0.016AC-0.014AD-0.014BC +5.643BD-0.016CD-0.11A2-0.030B2-3.652E-003C2-0.15D2，试验设计方案与结果见表4。

表4 拟合设计试验方案及结果

由表5 可知，二次多项式回归方程显著性明显，P=0.0002＜0.05，可以应用响应面法优化酸浆宿萼花色苷提取工艺。

表5 响应面法对酸浆宿萼花色苷提取量的方差分析表

表6 酸浆宿萼花色苷降糖活性

考察 2 个交互因素对酸浆宿萼花色苷提取量的影响，将表4 中的试验数据进行响应面曲面分析，结果见图5。料液比与超声时间交互作用对花色苷提取量影响最大，乙醇体积分数与料液比、超声时间与乙醇体积分数交互作用对花色苷提取量影响相对大，其他交互作用对花色苷提取量影响相对小。

图5 提取因素交互作用对花色苷提取影响的响应图

2.3 验证试验

由 Design-Expert8.0.6 软件分析，得出酸浆宿萼花色苷提取的最优条件。结果显示，酸浆宿萼花色苷提取的最佳条件是：料液比 1∶24.72 g·mL-1，乙醇体积分数 55.035%，超声温度 50℃，超声时间 19.72 min，其花色苷的提取量为 1.08872 mg·g-1。考虑到试验操作性，试验条件优化为：料液比 1∶25g·mL-1，乙醇体积分数 55 %，超声温度 50℃，超声时间 20 min。在优化实验条件下，进行 3 次验证试验，酸浆宿萼花色苷提取量为 1.063±0.012 mg·g-1。

2.4 酸浆宿萼花色苷降糖活性

酸浆宿萼花色苷与阿卡波糖对 α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制能力有明显差异（t=22.570、P=0.002，t=66.522、P=0.000）。

3 结论

通过响应面法优化了酸浆宿萼花色苷超声辅助提取的实验条件。与传统单纯溶剂提取相比，超声辅助提取能够提升提取率、保护环境、节能降耗，从工业化视角看，超声辅助提取已经应用到工业化生产中。本文实验条件简单、稳定，能够更好的与工业化生产相结合，可以作为提取酸浆宿萼花色苷的实验方法。

抑制 α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性，是医治 2 型糖尿病初期有效途迳。花色苷能够与这些酶结合，从而减少脂肪吸收、抑制餐后血糖升高。医治 2 型糖尿病的常规药物阿卡波糖容易引起如胃肠胀气、腹泻等不良副作用，将常规药物与具备生物效用的天然活性产物联合使用是减少药物副作用的可行途径[22]。糖尿病人体内自由基产物明显增多，这些自由基能够进一步导致炎症反应发生，抗氧化作用有利于防治糖尿病并发症和延迟糖尿病并发症的发生[23]。花色苷具有多个酚羟基，普遍具有优越的抗氧化功效[24]。酸浆宿萼花色苷有一定的体外降糖活性，可以与医治 2 型糖尿病的常规药物联合使用。实验结果为研究酸浆宿萼特性和开发酸浆宿萼功能食品提供理论参考。