人参药材抗氧化活性的研究

孙仁爽，赵敏婧，隋艳艳，谷伟强

（1.通化师范学院医药学院长白山天然药物重点实验室，通化 134002；2.梅河口市食品药品检验检测中心，梅河口 135000；3.吉林省通化振国药业有限公司，通化 134002；4.辽宁参中堂健康产业股份有限公司，本溪 117221）

人参是一种珍贵的中药材，具有较好的抗氧化活性。活性氧自由基可直接或间接造成 DNA 损伤，导致染色体和 DNA 链断裂。因此，如何清除氧自由基是中西医科学领域亟待解决的问题。人参、三七和西洋参中的主要有效成分均为皂苷类化合物[2]。研究表明，人参皂苷具有多种生物活性，几乎可作用于人体的各个生命系统。人参皂苷类化合物具有清除自由基的作用[3]，但人参皂苷是一种较弱的自由基清除剂，此特性在联合用药中有利于人参皂苷抗自由基作用的缓慢释放[4]。近年研究中多采用 Fenton、Haber—Weiss 等紫外分光光度计法进行分析。本文采用 DPPH 法分析皂苷类化合物清除自由基的能力，用 DPPH 法检测抗氧化活性是比较成熟的抗氧化活性评价方法[5]。抗氧化物可以与人参皂苷直接结合，DPPH 的颜色将会从紫色变为淡黄色，通过颜色的变化[6]，检测吸光值。吸光度的变化可以直接反映出人参皂苷的抗氧化活性。

1 仪器与试剂、试药

1.1 实验仪器

BIOBASE-EL10C 酶标仪，博科 Biobase；DF-Ⅱ加热式磁力搅拌器，北京六一仪器有限公司；离心机，江苏圣力离心机制造有限公司；BT243S 电子天平，北京赛多利斯仪器系列有限公司；中药粉碎机，北京旭鑫仪器设备有限公司；超声波清洗器，深圳市洁盟清洗设备有限公司。

1.2 实验试剂、试药

甲醇、DMSO、DPPH 均为分析纯；人参药材经通化师范学院张立秋副教授鉴定为五加科植物人参的干燥根及根茎，产地分别为清河镇、抚松县、黑龙江省尚志市。

2 实验方法与结果

2.1 实验方法

2.1.1 人参皂苷提取

取人参根及根茎，切成 1～2 cm 的小段，加水煎煮两次，第一次煎煮 2 h，第二次煎煮 1.5 h，煎煮液滤过，合并煎煮液，通过 D101 型大孔吸附树脂柱，水洗脱至无色，收集水洗液，再用 60%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩成浸膏，分离纯化药材中的人参皂苷，冻干后配制成梯度浓度的样品检测液，利用 DPPH 法鉴定样品检测液的抗氧化能力。

2.1.2 抗氧化能力的检测

将不同编号的样品检测液分别加入至 96 孔板内，体积为 100 μL，迅速加入 DPPH 溶液 100 μL。DPPH 溶液配制，称取 0.0158 g 样品，乙醇完全溶解后定容至 100 mL，离心后，避光静置 20min，利用分光光度计检测其在 515 nm 波长的吸光值，空白对照组为水，阳性对照组为 Vc。

自由基清除率=(1-Ai/A0）×100%

2.2 结果与分析

2.2.1 不同产地人参药材抗氧化分析

DPPH 法检测抗氧化活性是比较成熟的抗氧化活性评价方法。抗氧化物可以与人参皂苷直接结合，DPPH 的颜色将会从紫色变为淡黄色，通过颜色的变化，检测吸光值，根据吸光度的变化可以直接反映出人参皂苷的抗氧化活性。由图1 可知，在 1～15 mg/mL 试验范围内，随着样品浓度的增加，对 DPPH 的清除能力也会增加，与同等条件下的阳性对照 Vc 相比，二者具有显著的抗氧化活性。说明该方法能够检测出人参有效成分对 DPPH 的清除效率，进而反映出人参的抗氧化活性。

图1 自由基清除率与浓度的线性方程

基于以上，进一步检测了不同产地同一年限人参的抗氧化活性，详见图2。由于抚松三年人参的回归曲线 r 值较小，没有统计学意义，现仅探讨黑龙江尚志三年和清河三年人参药材的自由基清除率与浓度的关系。将数值分别带入两个回归曲线方程可得到，DPPH 清除率达到 50%时，黑龙江尚志三年人参 IC50值为 16.2 mg/mL，而清河三年人参的 IC50值为 20.3 mg/mL。说明黑龙江尚志三年人参的抗氧化活性高于清河三年人参。

图2 不同产地人参皂苷自由基清除率与浓度的回归方程

2.2.2 不同年限人参药材抗氧化分析

为了准确地检测出抚松人参的抗氧化活性，本实验选取二年、四年的抚松人参做进一步检测。通过对回归曲线方程的代入计算可得，两种年限的抚松人参都有较强的抗氧化活性，其中四年抚松人参的 IC50在6mg/mL。

为了检测不同年限人参药材的抗氧化能力，选取来自同一产地，同一品种，不同年限的人参药材，分离纯化得到皂苷之后冻干，配制成不同梯度浓度的样品溶液，同样利用 DPPH 法对人参皂苷的抗氧化能力进行测定。由图3 可知，抚松人参的抗氧化活性随着年限的增长而显著提高。为了进一步确认抗氧化活性与人参年限的关系，选取了清河不同年限人参以及黑龙江尚志不同年限人参作为材料，进行抗氧化活性检测。

图3 抚松不同年限人参皂苷自由基清除率与浓度的回归方程

通过对回归曲线的带入计算可得，清河十二年人参的 IC50值为 5.7 mg/mL，清河六年人参的 IC50值与十二年人参比较接近，远低于清河五年、清河四年以及清河三年人参。说明清河人参随着年限的增加，抗氧化活性也会随之提高，清河五年人参以及以后年限的人参抗氧化活性不会随着年限增长而显著提升。详见图4。

图4 清河不同年限人参总皂苷清除率与浓度的回归方程

为了进一步确认不同年限人参抗氧化活性与浓度的关系，选择了黑龙江尚志三年、黑龙江尚志五年、黑龙江尚志八年人参以及林下参 25 年为材料。通过对回归曲线的带入计算可得，林下参 25 年的 IC50值远远低于其他年限的黑龙江尚志人参，最低为 6.0 mg/mL，黑龙江尚志三年，黑龙江尚志五年和黑龙江尚志八年人参随着年限的增长，其 IC50逐步降低。说明其抗氧化活性与其年限具有正相关性。详见图5。

图5 黑龙江不同年限人参皂苷自由基清除率与浓度的回归方程

3 讨论

本研究选取清河、抚松、黑龙江尚志等地所产人参，提取人参根及根茎总皂苷，以 Vc 作为抗氧化活性的阳性对照，检测人参的抗氧化活性，其中在 1～15 mg/mL 试验范围内，随着样品浓度的增加，对 DPPH的清除能力也会增强，与同等条件下的阳性对照 Vc相比，二者均具有显著的抗氧化活性。说明该提取方法能够检测出人参皂苷对 DPPH 的清除效率，进而反映出人参的抗氧化活性。为了进一步鉴定不同产地人参的区别，选取了抚松三年，清河三年以及黑龙江尚志三年人参作为实验材料，进行抗氧化活性的检测。结果表明，三种人参的抗氧化活性确实存在差异，说明同一品种不同产地，其抗氧化活性具有一定的差别。随后，又鉴定了同一产地不同年限人参的抗氧化活性差异。首先检测了抚松两年，三年和四年人参的抗氧化活性，发现抚松四年人参的抗氧化活性明显优于抚松两年和三年。同样的方法，进一步鉴定了清河不同年限人参及黑龙江尚志不同年限人参的抗氧化活性，得出的结论是在一定年限内，人参的抗氧化活性会随着年限的增长而提高[7]。

综上所述，DPPH 法能够准确快速地检测人参皂苷的抗氧化活性。不同产地的人参药材，人参皂苷的抗氧化活性存在一定的区别[8]。而在不同年限的人参药材检测实验中发现，无论是抚松人参、清河人参还是黑龙江尚志人参，生长年限越长的人参药材其抗氧化活性也越高，说明不同年限的人参抗氧化能力有差异，随着年限的增长，人参的抗氧化能力会随之增强。