苍术素对非小细胞肺癌细胞上皮间质转化的影响及机制研究

朱亚兰 吕世文 曾晨欣 徐媛青

非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的主要病理类型，发病率与病死率较高，晚期NSCLC 患者多采取放疗或化疗的治疗方式，但长期使用化疗药物的患者易发生耐药性，影响患者预后，因此进一步寻找有效治疗药物对改善患者预后具有重要意义[1-2]。苍术素（atractylodin，ATR）是从苍术中提取的有效成分，具有降血糖、抗炎、促胃排空、利尿等作用，研究显示，ATR 在肝癌、胆管癌中具有抗肿瘤活性，如通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin，PI3K/Akt/mTOR）通路和p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）信号通路抑制胆管癌细胞增殖并诱导胆管癌细胞自噬[3-4]。Janus 激酶2/信号转导子与转录激活子3（Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3）通路在肿瘤的转移与侵袭及肿瘤耐药中发挥重要作用，抑制JAK2/STAT3 信号通路的激活可抑制肺癌细胞的增殖与侵袭[5-6]。目前，关于ATR 影响NSCLC 细胞耐药及其机制的研究尚未见报道。本研究探索ATR 对NSCLC 细胞上皮间质转化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）的影响及可能的作用机制，为其用于NSCLC 的治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及培养 人NSCLC 细胞HCC827（批号：CTCC-400-0172）购于浙江美森细胞科技有限公司；在含10% FBS、1%青-链霉素的DMEM 培养基中常规培养，细胞融合至80%时，消化细胞并传代培养。每2 d更新培养液。

1.1.2 主要试剂 ATR（纯度≥98%）粉剂购自成都植标化纯生物技术有限公司，批号：PCS0115，用二甲基亚砜溶解，配制成400.0 μmol/L 的母液，备用；CCK-8试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司，批号：E1008-1000；STAT3 激活剂Colivelin 购自MCE 公司，批号：HY-P1061A；兔抗人上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、锌指蛋白转录因子（Snail）1 购自Santa Cruz 公司，批号分别为sc-71008、sc-59987、sc-393172）；RIPA 裂解液、十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）-聚丙烯酰氨凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）凝胶配置试剂盒购自碧云天生物科技有限公司，批号为P0013B 和P0012A；磷酸化JAK2（p-JAK2）、JAK2、磷酸化STAT3（p-STAT3）、STAT3、β-肌动蛋白（β-actin）抗体购自碧云天生物科技有限公司，批号分别为AF1486、AF1489、AF1495、AF1492 和AF5003。

1.2 方法

1.2.1 细胞存活率检测 取对数生长期细胞以1×104/孔的密度接种于96 孔板中。分别加入10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 μmol/L 的ATR 处理24、48、72 h，根据CCK-8 检测试剂盒方法检测细胞生长情况，测定450 nm 处吸光度值，并计算细胞存活率。

1.2.2 细胞处理及分组 将对数生长期细胞分为对照组、ATR 药物低、中、高浓度组（ATR-L 组、ATR-M 组、ATR-H 组）、ATR+Colivelin 组，ATR-L 组、ATR-M 组、ATR-H 组分别使用10.0、20.0、40.0 μmol/L 的ATR 处理24 h，ATR+Colivelin 组 使 用40.0 μmol/L 的ATR 与0.5 μmol/L 的Colivelin 共同处理24 h，对照组仅加入等量的二甲基亚砜。

1.2.3 细胞划痕实验 取各组细胞稀释为1×105/ml的细胞悬液，取2 ml 加入6 孔板中，待细胞长满培养皿，使用20 μl 移液枪头在细胞层上进行划痕，PBS 洗去不贴壁的细胞，更换无血清培养基培养24 h，显微镜下观察并测量划痕宽度，计算划痕愈合率。

1.2.4 细胞侵袭实验 取各组细胞使用无血清稀释成2×105/ml 的细胞悬液，Transwell 小室铺稀释Matrigel 基质胶，待胶干后，上室加入100 μl 细胞悬液，下室加入含10%FBS的培养液，培养24 h。使用甲醛固定20 min，结晶紫染色，显微镜下随机选取5 个视野，观察侵袭细胞，计算平均每个视野的侵袭细胞数。

1.2.5 EMT 相关蛋白表达的检测 采用Western blot法。收集各组细胞，加入RIPA 裂解液提取总蛋白，检测蛋白浓度，SDS-PAGE 电泳分离蛋白并转膜，5%的脱脂奶粉封闭1 h，分别加入E-cadherin、N-cadherin、Snail1、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3 和βactin 抗体稀释液，4 ℃孵育过夜，洗膜后加入二抗室温孵育2 h，显影并拍照，以β-actin 为内参，Imge J 软件分析蛋白相对表达水平。

2 结果

2.1 不同浓度ATR 处理对细胞存活率的影响 随ATR 浓度升高，细胞存活率呈逐渐降低趋势；培养24 h，HCC827 细胞培养半数抑制浓度为（63.51±1.15）μmol/L。因此选择浓度为10.0、20.0、40.0 μmol/L 的ATR 进行后续实验，见图1。

图1 不同浓度ATR 处理对细胞存活率的影响

2.2 ATR 对细胞迁移与侵袭的影响 与对照组比较，ATR-L 组、ATR-M 组、ATR-H 组细胞划痕愈合率显著降低，侵袭细胞数显著减少，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；随ATR 浓度 升 高，ATR-L 组、ATR-M 组、ATR-H 组细胞划痕愈合率逐渐降低，侵袭细胞数逐渐减少，呈药物浓度依赖性（P＜0.05）；与ATR-H 组比较，ATR+Colivelin 组细胞划痕愈合率显著升高，侵袭细胞数显著增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 ATR 对细胞迁移及侵袭的影响

2.3 ATR 对细胞EMT 相关蛋白表达的影响 与对照组比较，ATR-L 组、ATR-M 组、ATR-H 组E-cadherin 蛋白相对表达水平均显著升高，N-cadherin、Snail1 蛋白相对表达水平均显著降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；随ATR 浓度升 高，ATR-L 组、ATR-M 组、ATR-H 组E-cadherin 蛋白相对表达水平逐渐升高，Ncadherin、Snail1 蛋白相对表达水平逐渐降低，呈药物浓度依赖性（P＜0.05）；与ATR-H 组比较，ATR+Colivelin 组E-cadherin 蛋白相对表达水平显著降低，Ncadherin、Snail1 蛋白相对表达水平显著升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图2。

图2 ATR 对细胞EMT 相关蛋白表达的影响（A：电泳图；B：EMT 相关蛋白相对表达水平）

2.4 ATR 对细胞JAK2/STAT3 通路相关蛋白表达的影响 与对照组比较，ATR-L 组、ATR-M 组、ATR-H 组p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相对表达水平均显著降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；随ATR浓度 升高，ATR-L 组、ATR-M 组、ATR-H 组p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相对表达水平逐渐降低，呈药物浓度依赖性（P＜0.05）；与ATR-H 组比较，ATR+Colivelin 组 细 胞p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白相对表达水平均显著升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图3。

图3 ATR 对细胞JAK2/STAT3 通路相关蛋白表达的影响（A：电泳图；B：JAK2/STAT3 通路相关蛋白相对表达水平）

3 讨论

肺癌表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突变阳性率较高[7-8]，吉非替尼为治疗EGFR 基因突变肺癌的一线药物，但患者易产生耐药性，从而影响治疗效果[9-10]。耐药已成为NSCLC治疗的主要难题，因此寻找新的治疗药物对于改善NSCLC 患者预后具有重要意义[11-12]。研究显示NSCLC的耐药与细胞EMT 有关，抑制EMT 可逆转NSCLC 耐药性[13-14]。

ATR 具有抗炎、抗菌、抗肿瘤和免疫调节等多种药理活性[15-17]。研究显示，ATR 可通过抑制P13K/Akt/mTOR 通路抑制乳腺癌细胞增殖，诱导氧化应激介导的细胞凋亡和自噬[18]。在肺癌中，ATR 通过调节活性氧介导的信号通路抑制肺癌细胞增殖、迁移，诱导细胞周期停滞与细胞凋亡[19]。以上研究表明ATR 对肺癌有一定抗肿瘤活性。本研究显示，10.0～160.0 μmol/L的ATR 均可显著抑制NSCLC HCC827 细胞增殖，与报道结果类似。NSCLC 细胞迁移和侵袭能力增加是肿瘤转移及病情恶化的重要原因之一[20-21]，本研究显示使用10.0、20.0、40.0 μmol/L 的ATR 处理HCC827 可显著抑制细胞迁移与侵袭，且呈药物浓度依赖性，表明ATR 在NSCLC 中表现为抗肿瘤性，与先前报道结果类似。E-cadherin、N-cadherin、Snail1 是EMT 标志物，Ecadherin 可维持细胞间黏附作用，N-cadherin 可促进细胞的迁移，发生EMT 时N-cadherin、Snail1 上调表达，E-cadherin 下调表达[22-23]。抑制NSCLC 细胞EMT 可显著抑制肿瘤恶性进展与耐药性[24]。本研究结果显示，使用ATR 可显著上调E-cadherin 表达，下调N-cadherin、Snail1 蛋白表达，提示ATR 可抑制NSCLC 细胞增殖、迁移、侵袭和EMT。

为进一步阐明ATR 抑制NSCLC 细胞增殖、迁移、侵袭的作用机制，本研究检测JAK2/STAT3 通路相关蛋白磷酸化水平。JAK2/STAT3 信号通路在参与调节细胞增殖、凋亡方面发挥重要作用，与肿瘤发生、发展密切相关，同时该通路还参与免疫调节和炎性反应过程[25-26]。JAK2 的 活 化 可 促 进STAT3 磷 酸 化，JAK2/STAT3 通路的激活可促进肿瘤细胞迁移、侵袭与EMT[27-28]。JAK2/STAT3 通路还与肿瘤耐药性有关，在肺癌中，β-榄香烯可能通过抑制JAK2/STAT3 信号通路激活，抑制肿瘤细胞增殖，诱导凋亡，降低肺癌细胞对紫杉醇的耐药性[29]。Chae 等[30]发现，ATR 可抑制JAK2、STAT3 的磷酸化，降低佛波醇12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯诱导的人肥大细胞中的IL-6 水平。另有研究显示，在胆管癌细胞系CL-6 中，ATR 以剂量依赖性和时间依赖性方式抑制STAT3 蛋白磷酸化，从而抑制CL-6 细胞的增殖和迁移[31]。本研究结果表明，ATR 可抑制NSCLC 细胞JAK2、STAT3 蛋白磷酸化水平，且呈药物浓度依赖性，提示ATR 具有抑制JAK2/STAT3 通路激活的作用；给予STAT3 激活剂Colivelin 后，ATR 对JAK2、STAT3 蛋白磷酸化水平的抑制作用减弱，同时细胞增殖、迁移和侵袭能力增强，证实ATR 对NSCLC细胞增殖、迁移、侵袭与EMT 的抑制作用可能是通过抑制JAK2/STAT3 通路活化实现的。

综上所述，ATR 通过抑制JAK2/STAT3 通路抑制NSCLC 细胞增殖、迁移与EMT，ATR 在NSCLC 中的抗肿瘤活性仍需结合动物模型进行更深入的研究。