HPLC法同时测定消炎止咳片中3种黄酮类成分

周兴卓

【摘 要】

目的：建立高效液相色谱法（HPLC）同时测定消炎止咳片中芦丁、槲皮素、芹菜素含量。方法：以phenomonex-C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）为色谱柱，以甲醇（A）-0.4%磷酸水（B）为流动相，梯度洗脱，检测波长为360 nm，流速为1.0 mL·min-1，柱温为30 ℃。结果：芦丁、槲皮素、芹菜素在质量浓度分别为1.108～110.8 μg·mL-1、1.264～126.4 μg·mL-1、1.016～101.6 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系，加样回收率分别为99.24%、98.93%和100.98%。结论：所建立的方法简便易行、准确可靠且重复性好，适用于消炎止咳片的质量控制，可作为其质量评价方法。

【关键词】

HPLC；消炎止咳片；芦丁；槲皮素；芹菜素

【中图分类号】R927.2   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2023）05-0038-04

Simultaneous Determination of Three Components in Xiaoyan Zhike Tablets by HPLC

ZHOU Xingzhuo

The affiliated hospital of Qingdao university， Qingdao 26600， China

Abstract：

Objective To establish an HPLC method for the simultaneous determination of rutin， quercetin and apigenin in Xiaoyan Zhike tablets. Methods Phenomonex- C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μ m） As a chromatographic column， with methanol （A）-0.4% phosphoric acid water （B） as the mobile phase， gradient elution， the detection wavelength is 360 nm， the flow rate is 1.0 mL·min-1， and the column temperature is 30 ℃. Results The mass concentrations of rutin， quercetin and apigenin were 1.108-110.8， 1.264-126.4 and 1.016-101.6 respectively μ There was a good linear relationship with the peak area in the range of 1.108-110.8μg·mL-1、1.264-126.4μg·mL-1、1.016-101.6 μg·mL-1. The recoveries were 99.24%， 98.93% and 100.98% respectively. Conclusion The established method is simple， accurate， reliable and reproducible. It is suitable for the quality control of Xiaoyan Zhike tablets and can be used as a quality evaluation method.

Keywords：

HPLC; Xiaoyan Zhike Tablets; Rutin; Quercetin; Apigenin; Quality Control

消炎止咳片由胡頹子叶、太子参、百部、桔梗等 9 味中药组成，用于治疗气管炎、胸满气逆、咳嗽痰多等［1］，其现行质量控制标准国家食品药品监督管理局标准（YBZ19262005）中仅收载了以穿心莲为指标成分的含量测定方法和以麻黄为对照的薄层色谱定性鉴别方法，但仍无法全面体现质量标准的可控性、科学性。处方中君药胡颓子叶具有止咳平喘、止血解毒的功效［2］，含有黄酮、生物碱、萜等类等化合物［3］。目前，消炎止咳片制剂还未见以君药胡颓子叶主要活性成分为指标成分的质量控制方法研究报道，故本实验以芦丁、槲皮素、芹菜素为指标成分，建立了消炎止咳片制剂中3种黄酮类成分的HPLC含量测定方法，以期为消炎止咳片的质量标准提高完善提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Waters2695高效液相色谱仪（Waters公司）；KQ-500DE型超声机（昆山市超声仪器有限公司）；CPA225D十万分之一型电子天平（德国赛多利斯）。

1.2 试药 对照品：芦丁（批号：100080-201811）、槲皮素对照品（批号：100081-200406）、芹菜素对照品（批号：AF9032008）购自中国药品生物制品检定所，不同批次消炎止咳片购自平和药房。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 以phenomonex-C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）为色谱柱，以甲醇（A）-0.4%磷酸水（B）为流动相，梯度洗脱，检测波长为360 nm，流速为1.0 mL·min-1，柱温为30 ℃；进样量10 μL。梯度洗脱程序为：0～15 min，40%～45%（A）；15～20 min，45%～52%（A）；20～40 min，52%～55%（A）；40～55 min，55%～80%（A）。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取干燥后的芦丁对照品11.08 mg、槲皮素对照品12.64 mg、芹菜素对照品10.16 mg至100 mL的量瓶中，加甲醇制成质量浓度分别为110.8、126.4和101.6 μg·mL-1的混合对照溶液，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取消炎止咳片20片，去除包衣，研细，取约1.0 g，置25 mL锥形瓶中，加入10 mL甲醇，称重，超声提取30 min，放冷，称重，用甲醇补齐至失重，过滤，摇匀，即得。

2.2.3 阴性溶液的制备 按处方比例及生产工艺制备不含胡颓子叶的阴性样品，同法制备阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 分别精密吸取上述制备的对照品、供试品、阴性对照溶液10 μL，注入HPLC色谱仪，按“2.1”项下色谱条件分析。色谱图如图1所示。

2.3.2 线性关系考察 分别精密吸取“2.2.1”项下溶液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL、10.0 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度。分别吸取10 μL注入HPLC分析，以峰面积Y对进样浓度X进行线性回归计算，结果芦丁、槲皮素、芹菜素在质量浓度为1.108～110.8 μg·mL-1、1.264～126.4 μg·mL-1、1.016～101.6 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好线性关系，回归方程分别为Y=37518X+2089（r=0.9997）、Y=50143X-6472（r=0.9998）和Y=42812X+8835（r=0.9996）。

2.3.3 精密度试验 精密吸取上述混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，连续6次，记录峰面积并计算RSD，结果见表1。结果显示，芦丁、槲皮素、芹菜素的RSD分别为1.07%、0.81%、1.85%。表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取同一批号（200916）样品，按“2.2.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算RSD，结果见表1。结果显示，芦丁、槲皮素、芹菜素的RSD分别为1.97%、0.49%、2.01%。表明方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取同一批号（200916）供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别在0 h、2 h、4 h、8 h、10 h、12 h、24 h进样测定，记录峰面积并计算RSD，结果见表2。结果显示，芦丁、槲皮素、芹菜素的RSD分别为1.62%、1.59%、0.64%。表明3种成分在甲醇溶液中24 h内稳定。

2.3.6 加样回收试验 取已知含量（200916）的样品6份，每份约0.5 g，按1∶1的比例加入3种对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析，计算回收率。结果见表3。

2.3.7 样品含量测定 取不同批次样品约1. 0 g，每个批次平行3份，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析。测定结果见表4。

3 讨论

3.1 流动相的选择 本试验分别考察了甲醇、乙腈以及甲醇-水、甲醇-酸水、乙腈-水、乙腈-酸水等不同组成和比例的流动相［4］。结果显示，以甲醇-0.4%磷酸水为流动相为流动相时，各色谱峰之间能够有效分离，峰形相对较好，无拖尾现象。因此，选择甲醇-0.4%磷酸水为流动相进行洗脱。

3.2 提取方法的选择 本实验分别考察了甲醇、乙醇提取，超声、回流提取，40%、60%、80%的甲醇提取，1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的料液比，以及15 min、30 min、45 min、60 min的提取时间，结果显示以甲醇为溶剂，1∶25的料液比，超声提取30 min最佳。

3.3 检测波长的选择 据报道［5］，芦丁的检测波长为254 nm，槲皮素的检测波长为360 nm，芹菜素的检测波长为365 nm。分别考察254 nm、360 nm、365 nm波长下的测定效果，发现以360 nm为检测波长时，3个峰的峰型和分离度最好，基线最平。

4 小结

不同批次的消炎止咳片3种黄酮类成分的HPLC含量测定结果显示，不同批次之间的消炎止咳片中3种黄酮类成分含量存在一定的差异，可能和原药材的质量及片剂的制剂工艺等因素相关。本实验建立的消炎止咳片中3种黄酮类成分的HPLC含量测定方法，所建立的方法快速简便，精密度、稳定性、重复性好，专属性强，可为消炎止咳片的质量控制和质量评价提供依据。

参考文献

［1］徐飞鹤. 高效液相色谱法测定消炎止咳片中盐酸麻黄碱的含量［J］. 中国医院药学杂志， 2012， 32（23）：1931-1932.

［2］杨梦璇， 庄秀玲， 孙雪雁， 等. 大叶胡颓子叶止咳作用的研究［J］.  时珍国医国药， 2014， 25（6）：1343-1344.

［3］覃勤， 钟大妹， 吕倩， 等. 胡颓子叶中总黄酮及三种指标成分的含量测定方法研究［J］. 时珍国医国药， 2016， 27（3）：535-538.

［4］毛坤军， 黄平， 周慧云， 等. HPLC同时测定祛痰止咳胶囊中3种活性成分含量［J］. 中国合理用药探索， 2017， 14（6）：57-59，63.

［5］李进， 谢云， 定天明， 等. 一測多评法测定金樱子中黄酮类成分的含量［J］. 中药材， 2021， 44（2）：399-402.

（收稿日期：2020-07-13 编辑：刘 斌）