捏脊疗法对自闭症模型大鼠焦虑样行为及NF-κB通路的影响

龚梦华 吴倩雯 李一纯 唐佳瑶 林丽莉

摘要：目的 基于NF-κB通路探究捏脊療法对自闭症模型大鼠焦虑样行为及海马神经炎症的影响。方法 将12只 Wistar 孕鼠随机分为正常组和造模组，每组6只。于妊娠12.5 d，2组孕鼠均按体质量0.24 mL/100 g，腹腔注射给药，造模组腹腔注射250 mg/mL丙戊酸钠溶液（VPA），正常组腹腔注射等体积生理盐水；所产子代经睁眼试验、方向趋向性实验筛选后确定为自闭症模型大鼠。造模成功后将自闭症模型大鼠随机分为模型组和捏脊组，每组12只；正常组随机选取12只作为正常对照组。捏脊组出生后第23 d开始干预，每天1次，21遍/次，连续干预30 d。末次干预后采用旷场实验检测大鼠焦虑水平，Western blot检测大鼠海马组织中NF-κB p65、TNFR 1和TNFR 2蛋白表达，Real-time PCR检测大鼠海马组织中TNF-α、IKKα mRNA表达水平。结果 与正常组仔鼠比较，造模组仔鼠睁眼时间更晚，方向趋向性机能降低（P<0.01）；与正常对照组比较，模型组Rd值下降（P<0.01），NF-κB p65、TNFR1蛋白和TNF-α mRNA表达升高（P<0.01）；与模型组比较，捏脊组Rd值明显上升（P均<0.01），NF-κB p65、TNFR 1蛋白和TNF-α mRNA表达降低（P<0.01）；3组TNFR 2蛋白和IKKα mRNA表达水平无差异（P>0.05）。结论 捏脊疗法可有效改善自闭症大鼠焦虑样行为，其作用可能是通过抑制NF-κB通路的过度激活而实现的。

关键词：捏脊疗法；自闭症；NF-κB通路；焦虑样行为

中图分类号：R244.1 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2023）04-0081-05

Effect of Chiropractic Therapy on Anxiety-like Behaviorand NF-κB Pathway in Rats with Autism

GONG Meng-hua¹， WU Qian-wen¹， LI Yi-chun¹， TANG Jia-yao¹， LIN Li-li²

（1. Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China;2. Fujian Academy of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350003， China）

【Abstract】Objective： To study the effect of chiropractic therapy on anxiety-like behavior and hippocampal neuroinflammation in rats with autism based on NF-κB pathway. Methods： 12 Wistar pregnant mice were randomly divided into normal group and modeling group， 6 mice each group. At 12.5 days of gestation， the pregnant mice in the two groups were injected intraperitoneally according to their body weight of 0.24mL / 100g. The modeling group was injected intraperitoneally with 250 mg/mL sodium valproate solution （VPA）， and the normal group was injected intraperitoneally with normal saline. The offspring were selected by eye opening test and orientation test as autistic model rats. The model rats were randomly divided into model group and chiropractic group， 12 rats each group. 12 rats in the normal group were randomly selected as the normal control group. In the chiropractic group， intervention began on the 23rd day after birth， once a day， 21 times/time， continuous intervention for 30 days. After the last intervention， the anxiety level of the rats was detected by open field test， the protein expressions of NF-κB p65， TNFR 1 and TNFR 2 in the hippocampus were detected by Western Blot， and the mRNA expressions of TNF-α and IKKα in the hippocampus were detected by Real-time PCR. Results： Compared with that of the normal group， the eye opening time of the rats in the model group was later and the direction-oriented function was decreased （P<0.01）. Compared with that in the normal control group， Rd value in the model group was decreased （P<0.01）， and mRNA expressions of NF-κB p65， TNFR1 protein and TNF-α were increased （P<0.01）. Compared with that in the model group， Rd value in the chiropractic group was significantly increased （P<0.01）， and mRNA expressions of NF-κB p65， TNFR 1 protein and TNF-α were decreased （P<0.01）. There were no differences in the expression levels of TNFR 2 protein and IKKα mRNA among the three groups （P>0.05）. Conclusion： Chiropractic therapy can effectively improve anxiety-like behavior in autistic rats， which may be achieved by inhibiting the over-activation of NF-κB pathway.

【Key words】Chiropractic Therapy; Autism; NF-kB Pathway; Anxiety-like Behavior

自闭症（ASD）是一种以社会交往障碍、重复刻板动作和兴趣狭窄为核心症状的综合性神经发育障碍性疾，儿童是其主要患病人群，在中国6～12岁的儿童中，ASD患病率约为0.7%^［1-2］。ASD个体共病率高，其中焦虑是本病最普遍的共病之一，严重焦虑可加重自闭症核心症状，进而导致继发性行为问题^［3-4］。ASD具有高度异质性，且致病因素复杂，有证据表明，ASD患者脑内诱导型转录因子核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的上调与自闭症的发生发展有关^［5］。

捏脊疗法是祖国医学中常用的中医外治法，具有调阴阳、和脏腑、疏经络、理气血、培元气、健脾胃等功效^［6］。临床研究表明，捏脊疗法可显著改善精神发育迟滞患儿社交障碍、焦虑等自闭样行为^［7-9］，但是捏脊通过何种途径产生效应仍尚未明确。因此，本实验通过产前宫内暴露戊丙酸钠（VPA）建立自闭症模型，探究捏脊疗法对自闭症模型大鼠焦虑样行为的影响及其可能机制，为临床捏脊疗法的推广应用提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级Wistar大鼠雌雄各12只，7～8周龄，体质量（200±20）g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号为SCXK（沪）2017-0005，在福建中医药大学动物中心SPF级饲养室饲养1周，饲养环境安静，恒温（22±1）℃，每日12h固定照明（8：00开灯），并可自由摄取食物和水，合格证号为SYXK（闽）2014-001。

1.1.2 主要试剂 丙戊酸钠（美国sigma公司）；RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，型号：P0013B、RT506、P0010）；NF-κB p65一抗、TNFR1一抗、GAPDH一抗、二抗（武汉三鹰生物技术有限公司，型号：15506-1-AP、21574-1-AP、10494-1-AP、SA00001-2）；TNFR2一抗（武汉博士德生物工程有限公司）；Trizol（南京诺维赞生物科技有限公司R401-01）；所用引物均由上海尚亚生物公司根据设计合成。

1.1.3 主要仪器 旷场实验箱（上海欣软信息科技有限公司）；PowerPac Universa电泳仪（美国BIO-RAD公司）；ChemiDocXRS+化学发光成像分析系统（美国BIO-RAD公司）；Infinite M200 PRP 全自动酶标仪（瑞士TECAN公司）。

1.2 方法

1.2.1 实验方法

1.2.1.1 模型制备^［10］育龄期SPF级Wistar大鼠雌雄各12只，雌雄1∶1合笼过夜，次日清晨查看，观察雌鼠出现阴栓记为胚胎第0.5天（embryofoday，E0.5）后，将雌雄分笼饲养，并将孕鼠随机分成正常组和造模组。2组孕鼠均按体质量0.24 mL/100 g，腹腔注射给药，造模组腹腔注射250 mg/mL丙戊酸钠溶液（VPA），正常组腹腔注射等体积生理盐水；所产子代经方向趋向性实验、睁眼实验筛选后确定为自闭症模型鼠。

1.2.1.2 发育行为学检测 仔鼠出生一周后进行发育行为学检测，与正常组比较，筛选出具有明显自闭症样行为的小鼠为自闭症模型鼠。仔鼠出生当日为产后第1天，记PN1（postnatal day，PN）。（1）方向趋向性检测：于PN7～PN10对仔鼠进行检测，将仔鼠头朝向下方置于倾斜角度25°的光滑斜板上，记录其转身角度180°所需时间。（2）睁眼试验：于幼鼠PN12～PN16时观察其睁眼情况，以未睁眼记０分、睁1只眼记1分、全睁眼记为2分。

1.2.1.3 实验分组及捏脊干预 造模成功后将自闭症模型大鼠随机分为模型组和捏脊组，每组12只，正常组随机选取12只作为正常对照组。捏脊组PN23开始干预，每日3：00～5：00pm（膀胱经循行时间段）进行捏脊，1次/d，21遍/次（根据课题组前期研究结果确定^［7］），连续干预30 d。

捏脊的具体操作方法：实验者左手以毛线手套盖住大鼠头部并以轻柔的方式固定，右手的拇指指腹与食中二指相对用力，捏起大鼠脊柱两侧的皮肤进行提捏。仿照临床上对人类捏脊的手法，从大鼠脊中线尾根部开始，边捏边向上推移，捏3提1，一直捏到大椎穴处停止，計为1遍，手法的刺激强度以大鼠忍耐为度（即大鼠不发出尖叫，较平静）。捏脊疗法中涉及到的相关穴位按《实验针灸学》比照人体穴位来选取。

1.2.1.4 组织标本的采集 旷场实验结束后开始禁食、禁水，24h之后用戊巴比妥钠（1 mL/100 g）麻醉大鼠后断头，剪开头皮，用血管钳揭去颅骨和硬脑膜，剪断双侧视神经后用眼科镊子迅速取出大鼠的整个脑组织。按照《大鼠脑立体定位图谱》剥离两侧海马，用0.9% 氯化钠溶液冲洗干净，置于事先做好标记的冻存管中，经液氮速冻后取出，转存于-80 ℃冰箱待测。

1.2.2 观察指标

1.2.2.1 旷场试验 末次干预后（PN53）进行旷场实验。利用SuperMaze软件在旷场箱内划分中央区和边缘区，优先记录实验鼠在旷场箱内5min（T）活动的总距离（DT）和中央区活动距离（Dc），计算出小鼠在中央区活动距离占总活动距离的比值Rd（Rd=Dc/DT）。比较各组Rd值，数值越小焦虑程度越高。

1.2.2.2 Western blot检测海马组织中NF-κB p65、TNFR1和TNFR2蛋白表达 称取冻存的海马组织置入匀浆器，PBS冲洗后加入RIPA 裂解缓冲液，研磨离心后提取蛋白、BCA法测定浓度。配制电泳所需的分离胶与浓缩胶，上样到 SDS-PAGE胶加样孔内，每条泳道蛋白样品上样量为20μg。电泳时，恒流200mA电流转膜，1.5 h。转模、封闭、一抗孵育（NF-κB p65、TNFR1、TNFR2、GAPDH抗体，1∶400）、二抗孵育、使用ImageLab系统进行图象扫描和结果分析。

1.2.2.3 Real-time PCR检测大鼠海马组织中TNF-α、IKKα mRNA表达水平 取各组大鼠海马组织样本，采用RT-PCR检测大鼠海马组织中TNF-α、IKKα mRNA表达水平。提取总RNA进行逆转录，得到的cDNA按扩增流程进行扩增，StepOneSoftwarev2.2.2收集数据，延伸结束后收集荧光。根据扩增曲得出每个样品的Ct值（thresholdcycle，Ct值），由此算出基因的相对表达量（管家基因/参照基因：GAPDH）。引物序列见表1所列。

1.2.3 统计学方法 实验所得数据使用SPSS26.0软件进行分析。计量资料符合正态分布以均数±标准差（x?±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析法（one-way ANOVA），组间差异有统计学意义时，进一步采用LSD检验；不符合正态分布的以中位数和四分位数来表示，采用非参数检验。

2 结果

2.1 模型制备-发育行为学检测

2.1.1 2组仔鼠方向趋向性测试结果比较 见图1。

2.1.2 2组仔鼠睁眼实验评分比较 见图2。

2.2 各组大鼠旷场实验结果比较 见表2。

2.3 各组海马组织中NF-κB p65、TNFR1和TNFR2蛋白表达比较 见表3。

2.4 各组海马组织中TNF-α、IKKα mRNA相对表达量比较 见表4。

3 讨论

本实验以VPA诱导的ASD模型大鼠作为研究对象，该模型在可重复性、表面效度、构建效度和预测效度等方面均受到广泛认可^［11］。然而目前ASD模型的确立仍缺乏较统一的生物学指标，其构建成功与否主要依赖于子代发育行为学评估。本实验结果显示，与正常组仔鼠比较，造模组仔鼠出现睁眼时间延后及方向趋向性机能降低的特点，这表明造模组仔鼠存在生长发育迟缓、前庭功能及运动协调机能低下的特点，符合临床上自闭症患儿的发育行为学特征，提示ASD模型制备成功。

《难经》曰：“督脉者……上至风府，入属于脑^［12］。”督脉自人体尾骶部而起终入络脑，上输脏腑精微，若督脉亏虚瘀滞，则脑髓虚空而致病。因此，素有“病变在脑，首取督脉”之说。捏脊疗法的记载首见于晋·葛洪的《肘后备急方》：“治卒腹痛……拈取其脊骨皮，深取痛引之，从龟尾至顶乃止，未愈更为之”，其主要作用于督脉和膀胱经，能够起到通督调神、治疗神志病的作用^［6］。旷场实验被广泛应用于锯齿类动物焦虑及抑郁行为测试中，观察被测试动物在面对新环境时出现的兴奋性和适应性表现，分析其焦虑水平，其中“中央区活动距离比值（Rd）”为测试ASD模型焦虑水平的常用指标^［13］。

NF-κB信号通路是介导炎症反应的关键信号通路之一。NF-κB普遍存在于中枢神经系统，在静息状态下以p65/p50二聚体的形式被核因子κB（inhibitor of nuclear factor kappa-Bα，IκBα）结合并锚定在细胞质内，在信号分子的作用下，IκBα的激酶 IKKα /β 被磷酸化并激活，IκBα发生磷酸化并降解，使NF-κB暴露并增强核定位信号，由胞浆转移至胞核并启动转录信号，产生炎性因子^［14-15］。NF-κB调控转录的炎性因子具有正反馈的瀑布效应^［16］，在自闭症发生、发展过程中，NF-κB被激活，活化后的NF-κB可促进大量炎性因子的释放，而这些因子亦可反作用于NF-κB的激活，从而放大炎症级联反应、破坏血脑屏障并导致不可逆的神经元损伤，最终影响认知功能及焦虑抑郁样行为^［17］。肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）作为一种多效性细胞因子，由过度活化的小胶质细胞产生，参与神经炎症、细胞存活等多种生物学活动，TNF-α及其跨膜受体肿瘤坏死因子受体1（tumor necrosis factor receptor，TNFR1）是有效的促炎细胞因子，在引发和维持炎症反应中起着核心作用^［18］。

本次實验结果显示，VPA诱导的自闭症模型大鼠焦虑样行为与海马组中NF-κB p65、TNF-α和TNFR1表达明显升高有关。NF-κB p65高度表达，可促进炎性因子TNF-α释放，TNF-α不仅可以直接产生神经毒性，亦可通过与TNFR1结合而引发NF-κB的瀑布效应，导致ASD反应的发展和加重，进而诱发或加重焦虑样行为。予以捏脊疗法干预后，海马组织中的NF-κB p65、TNF-α和TNFR1表达均明显减少，提示捏脊疗法可通过抑制神经炎症的过度反应，达到改善ASD焦虑样行为的作用。研究发现，TNF所引起的NF-κB激活在IKKα和IKKβ双缺陷小鼠身上被完全消除，因此，IKKα和IKKβ被认为是NF-κB激活中必不可少的一环^［19］。本实验结果显示，与正常对照组比较，模型组和捏脊组海马组织中IKKα表达无统计学意义，提示在TNF介导的NF-κB激活途径中，激酶IKKβ或许扮演着更为重要的角色。

综上，捏脊疗法可显著改善ASD模型大鼠焦虑样行为，其作用可能是通过抑制NF-κB炎症通路的过度激活，减轻大脑炎症反应而实现的。自闭症的发生、发展与小脑、皮质和胼胝体等多个脑区有关，然而本实验因技术、时间有限，未涉及其它自闭症相关脑区，这将是本团队下一步研究方向，为临床实践提供理论基础。

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（收稿日期：2022-08-10）