急性脑梗死患者外周血Keap1-Nrf2/ARE信号通路变化与预后的相关性分析

张欢,祝善尧,葛伟,洪斌,刘爽

近年来,随着溶栓、介入等再灌注治疗手段的迅速发展,急性脑梗死(acute cerebral infarction,ACI)的治疗效果得到显著提高,但临床实践中仍有部分患者遗留不同程度神经功能缺损,难以获得良好的预后[1-2]。有研究统计,ACI患者静脉溶栓治疗后近期预后不良发生率高达42.70%,需给予重视[3]。因此,及早有效预测ACI患者预后情况成为研究热点。目前,大量研究表明,ACI患者发生发展过程中与神经功能缺损相关的环节较多,包括氧化应激反应、炎性反应、细胞凋亡等[4-5]。其中,Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-like epichlorohydrin-related protein-1,Keap1)-核因子E2相关因子2(nuclear factor E2 correlation factor 2,Nrf2)/抗氧化反应元件(antioxidant reaction element,ARE)是一种调控机体氧化应激反应、调节下游氧化/抗氧化因子表达的重要信号通路,能维持脑梗死后细胞内氧化还原平衡状态[6]。但关于该信号通路与ACI患者预后的关系仍缺乏确切的证据。为此,现分析ACI患者Keap1-Nrf2/ARE信号通路变化与预后的相关性,旨在为临床预测预后提供更多思路,报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2020年6月—2022年3月安徽医科大学附属巢湖医院神经内科诊治 ACI患者110例作为研究对象,其中男63例,女47例,年龄48～85(66.92±3.66)岁;梗死部位:前循环68例,后循环42例;神经功能缺损评分(National Institutes of Health Stroke Score,NIHSS)5～22(14.97±2.19)分;发病至溶栓时间1～4.5(2.73±0.41)h。根据溶栓后3个月改良Rankin量表评分评估短期预后,近期预后良好患者78例,mRs评分(1.81±0.17)分,近期预后不良患者32例,mRs评分(3.35±0.33)分;随访1年,失访6例,根据ACI是否复发统计,远期预后良好患者83例,mRs评分(1.75±0.24)分,远期预后不良患者21例,mRs评分(3.24±0.31)分。近、远期预后良好患者mRs评分低于近、远期预后不良患者,差异有统计学意义(t=32.212、23.898,P均<0.001)。远期预后良好患者83例,男48例,女35例,年龄48～85(65.83±4.12)岁;发病至溶栓时间1～4.5(2.65±0.51)h;诱因:情绪剧烈波动35例,劳累26例,精神紧张15例,其他7例;合并症:高血压15例,糖尿病9例,高脂血症12例。远期预后不良患者21例,男12例,女9例,年龄49～85(67.01±4.54)岁;发病至溶栓时间1～4.5(2.77±0.53)h;诱因:情绪剧烈波动10例,劳累6例,精神紧张3例,其他2例;合并症:高血压5例,糖尿病3例,高脂血症4例。2组一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会批准(2020031286),患者或家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准:发病4.5 h内,CT检查无责任脑梗死病灶;符合ACI相关诊断标准[7];具备静脉溶栓指征;无颅脑既往治疗史。(2)排除标准:合并脑出血、脑外伤等其他颅脑疾病的患者;参与本研究4周前有服用免疫抑制剂、抗凝等药物的患者;伴有严重全身性疾病的患者;存在凝血功能障碍、自身免疫疾病、呼吸道疾病的患者;合并恶性肿瘤的患者。

1.3 治疗与分组 患者入院后均根据实际情况给予相应对症治疗与支持治疗;发病4.5 h内给予阿替普酶静脉溶栓治疗,阿替普酶0.9 mg/kg,最大剂量控制在90 mg,静脉注射10%,持续性静脉泵入90%,于1 h内泵完。溶栓后24 h给予阿司匹林(拜耳医药保健有限公司)100 mg/d口服,阿托伐他汀20 mg/次口服,依达拉奉右莰醇30 mg+生理盐水100 ml静脉滴注,均为2次/d。以溶栓后3个月的改良Rankin量表(modified Rankin scale,mRs)评分[8]作为近期预后的评估依据,mRs评分≤2分判定为近期预后良好,mRs评分>2分判定为近期预后不良。随访1年,以ACI是否复发作为远期预后的评估标准,复发的判定标准[9]:患者出现新的神经功能缺损症状,经头颅MR、CT检查证实出现新的脑梗死病灶。无复发判定为远期预后良好,复发判定为远期预后不良。

1.4 观察指标与方法

1.4.1 外周血Keap1-Nrf2/ARE信号通路相关蛋白水平检测:于溶栓前及溶栓后7 d、3个月抽取患者肘静脉血5 ml ,采用免疫印迹法检测Keap1、醌氧化还原酶1[NAD(P)H Quinone oxidoreductase 1,NQO1]、Nrf2、ARE蛋白相对表达量,试剂盒购自深圳市亚辉龙生物科技有限公司。严格按照试剂盒说明书操作,采用QuantityOne软件测定灰度值,计算蛋白条带灰度值与内条带灰度值比值,以此表示目的蛋白相对表达量。

1.4.2 病情程度评定:采用NIHSS评分[10],其内容包括意识程度、回答问题的能力、遵从指令的能力、眼球运动、视野、面部肌力、上肢运动功能、下肢运动功能、肢体协调、感觉功能、语言、构音、感觉忽视等。评分范围为0～42分,分数越高表示神经受损越严重。

2 结 果

2.1 不同近期预后组溶栓前后外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白表达、NIHSS评分比较 2组溶栓后7 d、溶栓后3个月Keap1蛋白相对表达量、NIHSS评分低于溶栓前,NQO1、Nrf2、ARE蛋白相对表达量高于溶栓前(P<0.01);近期预后不良组溶栓后7 d、3个月Keap1蛋白相对表达量、NIHSS评分高于近期预后良好组,NQO1、Nrf2、ARE蛋白相对表达量低于近期预后良好组(P<0.01),见表1。

表1 不同近期预后组ACI患者溶栓前后外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白表达、NIHSS评分比较

2.2 不同远期预后组溶栓前后外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白表达、NIHSS评分变化比较 2组溶栓后7 d、溶栓后3个月Keap1蛋白相对表达量、NIHSS评分低于溶栓前,NQO1、Nrf2、ARE蛋白相对表达量高于溶栓前(P<0.01);远期预后不良组溶栓后7 d、3个月Keap1蛋白相对表达量、NIHSS评分高于远期预后良好组,NQO1、Nrf2、ARE蛋白相对表达量低于远期预后良好组(P<0.01),见表2。

表2 不同远期预后组ACI患者溶栓前后外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白表达、NIHSS评分比较

2.3 外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白与NIHSS评分的关系 ACI患者溶栓后7 d、3个月Keap1蛋白相对表达量与NIHSS评分呈正相关(P<0.01),NQO1、Nrf2、ARE蛋白相对表达量与NIHSS评分呈负相关(P<0.01),见表3。

表3 ACI患者NIHSS评分与外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白的关系 (r/P)

2.4 外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白对近远期预后的预测价值

2.4.1 近期预后的预测价值:绘制溶栓后7 d的外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白对ACI患者预测价值的ROC曲线,并计算曲线下面积(AUC),结果显示,溶栓后7 d的 Keap1、NQO1、Nrf2、ARE蛋白及四者联合预测近期预后不良的AUC为0.803、0.717、0.800、0.765、0.907,四者联合优于各蛋白单独预测价值(Z/P=2.105/0.026、2.413/0.004、2.113/0.021、2.205/0.016),见表4、图1。

图1 外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白预测ACI患者近期预后的ROC曲线

表4 外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白对ACI患者近期预后的预测价值

2.4.2 远期预后的预测价值:绘制溶栓后3个月的外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白对ACI患者预测价值的ROC曲线,并计算AUC,结果显示,溶栓后3个月的 Keap1、NQO1、Nrf2、ARE蛋白及四者联合预测近期预后不良的AUC为0.766、0.765、0.812、0.767、0.927,四者联合优于各蛋白单独预测价值(Z/P=2.238/0.010、2.241/0.008、2.115/0.019、2.231/0.012),见表5、图2。溶栓后3个月的外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白预测远期预后的AUC与溶栓后7 d的外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白预测近期预后的AUC比较,差异无统计学意义(Z/P=0.102/0.563)。

图2 外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白预测ACI患者远期预后的ROC曲线

表5 外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白对ACI患者远期预后的预测价值

3 讨 论

临床普遍认为,ACI发生发展机制较为复杂,其中公认的是除了病程中脑局部缺氧缺血直接导致的神经组织损害,还会在受损脑组织缺血再灌注基础上致使氧化应激反应被激活、氧自由基过多释放,造成脑细胞膜脂质过氧化,从而形成微循环障碍、加剧脑细胞结构破坏,成为间接造成神经组织损害的主要原因之一[11-13]。因此,积极探索氧化应激反应相关信号通路在ACI患者中的变化成为临床重要研究方向。

Keap1-Nrf2/ARE信号通路属于机体内重要的氧化应激信号通路,其中Keap1、Nrf2是机体氧化/抗氧化状态的重要调节中枢因子,ARE与Nrf2具有协调效应,参与氧化应激反应发生发展过程,NQO1是受Nrf2/ARE调控的抗氧化酶,能通过催化体内多种代谢途径达到抗氧化目的[14-15]。既往国内外均有研究证实,Keap1-Nrf2/ARE信号通路可通过调控局部脑细胞氧化应激损伤在脑血管疾病中发挥重要作用[16-17]。田琴等[18]报道表明,缺血性脑卒中患者外周血Keap1-Nrf2/ARE信号通路呈异常表达状态,与神经损伤密切相关。本研究发现,ACI患者溶栓后近期Keap1、NQO1、Nrf2、ARE蛋白相对表达量均与NIHSS评分密切相关,可见外周血Keap1-Nrf2/ARE信号通路相关蛋白水平改变与ACI患者神经功能缺损程度变化情况显著相关,是由于机体受到氧化应激刺激会立即修饰Keap1半胱氨酸残基,降低Nrf2稳定性,导致Keap1与Nrf2发生解离,促使Nrf2结合细胞核内的ARE,加快Nrf2/ARE之间的协调效应活化进程,调控超氧化物歧化酶、NQO1等下游基因的表达,参与神经功能损伤过程[19-21];在氧自由基大量释放时会造成过多的Nrf2在细胞内蓄积,逐渐向细胞核内转位,识别ARE,启动NQO1等多种抗氧化酶表达,发挥阻碍氧自由基生成作用,从而在ACI患者神经组织损害发生及修复过程中产生相应作用[22-23]。

同时,本研究发现ACI患者溶栓后近期Keap1蛋白相对表达量、NIHSS评分明显降低,NQO1、Nrf2、ARE蛋白相对表达量明显升高,其变化机制在于静脉溶栓后ACI患者脑部微循环、神经功能得到有效修复,脑细胞氧化应激反应损伤有所减轻,促使Keap1-Nrf2/ARE信号通路相关蛋白水平随之改善,这与该信号通路参与ACI氧化应激反应、神经功能损伤修复间接影响预后改善有关。此外,本研究创新性尝试探讨外周血Keap1-Nrf2/ARE信号通路相关蛋白对ACI患者近远期预后的预测价值,结果发现,溶栓后7 d的Keap1、NQO1、Nrf2、ARE蛋白联合预测近期预后的AUC最大,溶栓后3个月的Keap1、NQO1、Nrf2、ARE蛋白联合预测远期预后不良的AUC最大,均优于各蛋白单独预测,提示临床可通过检测外周血Keap1-Nrf2/ARE信号通路相关蛋白水平变化有效预测ACI患者近远期预后情况,有利于及早采取针对性干预措施,降低预后不良风险。不足之处:纳入样本量偏少,可能造成数据偏倚,且未对比外周血Keap1-Nrf2/ARE信号通路与常规影响因素预测预后价值的优劣,今后需收集更多病例,做进一步探究与分析,以获取更可靠的数据支持。

综上可知,ACI患者外周血Keap1-Nrf2/ARE信号通路变化与近远期预后显著相关,可作为有效预测近远期预后情况的重要辅助途径,能为临床制定改善预后方案提供可靠的参考依据。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

张欢:设计研究方案,实施研究过程,论文撰写;祝善尧:提出研究思路,分析试验数据,论文审核;葛伟、洪斌:实施研究过程,资料搜集整理,论文修改;刘爽:进行统计学分析