脑胶质瘤组织中miR-4744、RIOK2表达及其对患者预后的预测价值

段升强,乔建新,徐新文,刘熙鹏,张秀峰

脑胶质瘤恶性程度高、进展快、预后差,且多数情况下手术无法完全切除[1-2]。脑胶质瘤的预后评估具有重要意义,然而目前缺乏科学有效的判断方法。微小RNA(miRNA)可以与其他信使RNA(mRNA)的3'-非翻译区结合调节超过70%人类基因的表达[3]。研究发现,miRNA可参与调控影响肿瘤发生发展的肿瘤细胞增殖和侵袭等生物学行为[4]。微小RNA-4744(miR-4744)是通过二代测序在脑胶质瘤组织中鉴定的一种新miRNA,其过表达可抑制脑胶质瘤细胞迁移和侵袭[5],但miR-4744是否可影响脑胶质瘤患者预后尚未可知。右开放阅读框激酶2(RIOK2)是蛋白激酶(RIO)家族的成员,又被称为非典型激酶[6-7]。RIOK2在胶质母细胞瘤细胞中高表达,其过表达促进细胞增殖,其下调导致细胞凋亡并增加对化疗的敏感性[8-9]。因此,RIOK2在恶性肿瘤的进展中发挥促进作用,可能作为脑胶质瘤患者预后评估的生物指标。本研究检测miR-4744、RIOK2在脑胶质瘤组织中的表达,分析二者与患者临床病理特征和预后的关系,以期为脑胶质瘤患者的预后评估提供参考,报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2014年12月—2017年11月河北北方学院附属第一医院神经外科收治脑胶质瘤患者102例作为研究对象,手术中收集脑胶质瘤组织及相对应的癌旁正常组织(距肿瘤边缘≥3 cm)。男58例,女44例,年龄43～66(55.03±7.93)岁;肿瘤部位:额叶63例,颞叶25例,其他14例;肿瘤直径:<3 cm 50例,≥3 cm 52例;依据“中国中枢神经系统胶质瘤诊断和治疗指南”[10]肿瘤分级标准进行分级:Ⅰ～Ⅱ级57例,Ⅲ～Ⅳ级45例;有远处转移者56例,无远处转移者46例;卡氏功能状态(KPS)评分[11]:≥80分55例,<80分47例。本研究经医院伦理委员会批准(LS2014-083),患者或家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准:①患者符合相关指南制定的诊断标准[10],并结合病理检查和头颅CT检查结果最终确诊;②患者均为首次确诊,入院前未接受临床干预措施;③均行手术切除。(2)排除标准:①合并精神疾病;②合并其他脑部疾病;③心、肝、肾功能严重损害;④合并其他恶性肿瘤;⑤临床及随访资料不全;⑥妊娠、哺乳期女性。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 实时荧光定量PCR法检测miR-4744、RIOK2 mRNA表达水平:将脑胶质瘤组织及癌旁正常组织匀浆,Trizol试剂盒(批号RJ6829,购自北京鸿跃创新科技有限公司)提取组织中总RNA,逆转录得到cDNA,使用荧光定量PCR仪(型号Quantagene Q225,购自天津迦美惠众科技有限公司)及PCR试剂盒(批号HJ-39115,购自杭州九洋生物科技有限公司)进行扩增。miR-4744(内参基因U6)、RIOK2 mRNA(内参基因GAPDH)的引物序列均由南京有晴生物科技有限公司合成,引物序列见表1。反应条件:96℃ 3 min、 95℃ 30 s、59℃ 30 s、72℃ 40 s、71 ℃ 5 min,共进行38个循环。反应结束收集相应数据,并进行Ct值分析,以2-ΔΔCt算法计算miR-4744、RIOK2 mRNA的相对表达量。

1.3.2 免疫组化法检测RIOK2蛋白表达:制作脑胶质瘤组织和癌旁组织石蜡切片,脱蜡,修复抗原,3% H2O2浸泡15 min,阻断过氧化氢酶活性,加入兔抗人RIOK2单克隆抗体(批号HPA029069,购自德国Sigma公司),室温孵育1 h,4℃过夜,磷酸盐缓冲液清洗1次,而后加入二抗(批号PA1173,购自广东固康生物科技有限公司)孵育20 min,最后使用苏木素复染,脱水、封片,显微镜下观察染色结果:RIOK2蛋白染色阳性信号定位于胞质,呈中棕黄色颗粒,依据着色程度和着色百分比进行评定。着色程度:未着色0分,浅黄色1分,棕黄色2分,棕褐色3分。着色百分比:无染色记0分,<25%记1分,25%～<50%记2分,50%～<75%记3分,≥75%记4分[12]。两者乘积为半定量评价标准,≤2分为阴性,>2分为阳性。

1.3.3 预后随访:采用电话或门诊方式随访,随访期为5年,随访截止日期2022年11月30日。记录患者术后第1天到5年后的生存情况:102例均获访,患者死亡(死亡组)47例,生存(存活组)55例 。

2 结 果

2.1 脑胶质瘤组织和癌旁组织miR-4744、RIOK2表达比较 与癌旁组织比较,脑胶质瘤组织中miR-4744表达水平明显降低,RIOK2 mRNA和蛋白阳性率明显升高(P<0.01),见表2、图1。

图1 脑胶质瘤组织和癌旁组织RIOK2蛋白表达情况(免疫组化染色,×200)

表2 脑胶质瘤组织和癌旁组织miR-4744、RIOK2表达比较

2.2 脑胶质瘤组织miR-4744、RIOK2 mRNA表达水平与患者临床病理特征的关系 分别以脑胶质瘤组织miR-4744、RIOK2 mRNA表达水平的平均值(0.43、1.60)为临界值(≥平均值为高表达,<平均值为低表达),将患者分为miR-4744低表达组51例、miR-4744高表达组51例;RIOK2 mRNA低表达组34例、RIOK2 mRNA高表达组68例。结果发现,脑胶质瘤组织miR-4744、RIOK2 mRNA表达水平与性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤部位无关(P>0.05),与肿瘤分级、远处转移、KPS评分有关(P<0.01),见表3。

表3 脑胶质瘤组织miR-4744、RIOK2 mRNA表达水平与患者临床病理特征的关系 [例(%)]

2.3 脑胶质瘤组织miR-4744与RIOK2 mRNA表达水平的相关性分析 Pearson相关分析显示,脑胶质瘤组织miR-4744与RIOK2 mRNA表达水平呈负相关(r=-0.636,P<0.001)。

2.4 脑胶质瘤组织miR-4744、RIOK2 mRNA表达水平与预后的关系 Kaplan-Meier法分析显示,miR-4744低表达组患者5年生存率为31.37%(16/51),低于miR-4744高表达组的76.47%(39/51),差异有统计学意义(χ2=20.874,P<0.001);RIOK2 mRNA高表达组患者5年生存率为42.65%(29/68),低于RIOK2 mRNA低表达组的76.47%(26/34),差异有统计学意义(χ2=10.437,P=0.001),见图2。

图2 脑胶质瘤组织miR-4744、RIOK2 mRNA表达水平与预后的关系

2.5 多因素Cox回归分析脑胶质瘤患者预后的影响因素 以脑胶质瘤患者5年内生存情况(生存=0,死亡=1)为因变量,以肿瘤分级(Ⅰ～Ⅱ级=0,Ⅲ～Ⅳ级=1)、远处转移(否=0,是=1)、KPS评分(≥80分=0,<80分=1)、miR-4744(高表达=0,低表达=1)、RIOK2 mRNA(低表达=0,高表达=1)为自变量进行多因素Cox回归分析。结果显示,肿瘤分级Ⅲ～Ⅳ级、有远处转移、KPS评分<80分、miR-4744低表达、RIOK2 mRNA高表达是脑胶质瘤患者5年内死亡的独立危险因素(P<0.05),见表4。

表4 多因素Cox回归分析脑胶质瘤患者预后的影响因素

2.6 存活组和死亡组脑胶质瘤组织miR-4744、RIOK2 mRNA表达水平比较 与存活组比较,死亡组脑胶质瘤组织miR-4744表达水平明显降低,RIOK2 mRNA表达水平明显升高(P<0.01),见表5。

表5 存活组和死亡组脑胶质瘤组织miR-4744、RIOK2 mRNA表达水平比较

2.7 脑胶质瘤组织miR-4744、RIOK2 mRNA表达水平对患者5年内死亡的预测价值 绘制脑胶质瘤组织miR-4744、RIOK2 mRNA表达水平对患者5年内死亡的预测价值ROC曲线,并计算曲线下面积(AUC),结果显示,脑胶质瘤组织miR-4744、RIOK2 mRNA及两者联合预测患者5年内死亡的AUC分别为0.752、0.711、0.885,两者联合预测患者5年内死亡的AUC高于miR-4744、RIOK2 mRNA单独预测的AUC(Z/P=3.147/0.002、3.531/0.004),见表6、图3。

图3 脑胶质瘤组织miR-4744、RIOK2 mRNA表达水平预测患者5年内死亡的ROC曲线

表6 脑胶质瘤组织miR-4744、RIOK2 mRNA表达水平对患者5年内死亡的预测价值

3 讨 论

脑胶质瘤按照其恶性程度分为低级别(Ⅰ～Ⅱ级)和高级别(Ⅲ～Ⅳ级)胶质瘤,不同级别脑胶质瘤的治疗方法也不尽相同,预后也相差较大[13-14]。对临床来说,找到有效的胶质瘤预后判断指标很有必要。

miRNA可作为癌基因亦或肿瘤抑制因子,大量研究揭示了miRNA在胶质瘤进展中的失调[15]。Qiu等[16]研究显示,胶质瘤患者脑脊液中miR-1246呈低表达,与胶质瘤复发率相关,miR-1246升高可抑制胶质母细胞瘤的活化与生长。Song等[5]研究发现,miR-4744可负向调控RIOK2表达来抑制胶质瘤细胞上皮间充质转化和生长。本研究发现,脑胶质瘤组织中miR-4744表达水平显著低于癌旁组织,且miR-4744表达水平与肿瘤分级、远处转移、KPS评分有关,与Song等[5]研究结果相符,表明miR-4744参与脑胶质瘤的发生过程,且影响疾病的进展。Kaplan-Meier法分析结果显示,miR-4744低表达患者5年生存率低于miR-4744高表达患者,死亡组miR-4744表达水平低于存活组,说明miR-4744与患者预后有关,其低表达可能提示脑胶质瘤患者预后不良。随后的Cox回归分析也显示,miR-4744低表达是脑胶质瘤患者5年内死亡的独立危险因素。为评估miR-4744在脑胶质瘤患者预后中的应用价值,本研究进行了ROC曲线分析,结果发现miR-4744预测患者5年内死亡的AUC为0.752,表明其对脑胶质瘤患者预后有一定的预测价值。

RIO激酶参与前糖体RNA加工和核糖体生物合成,其在核糖体合成和细胞周期进程中都发挥着关键作用,可调节肿瘤细胞生长[17-18]。近年来,关于RIO激酶参与肿瘤的研究逐渐增多。Messling等[19]发现,靶向抑制RIOK2可促使急性髓系白血病蛋白质合成减少和白血病细胞死亡。Matsuzaki等[20]研究报道,RIOK2水平与舌鳞状细胞癌患者生存率密切相关,敲低RIOK2表达可抑制口腔鳞状细胞癌细胞的生长。Yu等[21]研究发现,RIOK2在胶质母细胞瘤中过度表达,抑制RIOK2活性可使胶质母细胞瘤细胞周期阻滞和凋亡,从而发挥抗肿瘤作用。本研究发现,脑胶质瘤组织中RIOK2 mRNA和蛋白阳性率明显高于癌旁组织,且RIOK2 mRNA表达水平与肿瘤分级、远处转移、KPS评分有关,与Yu等[21]研究结果一致,说明RIOK2可能参与了脑胶质瘤的发生和进展,且与脑胶质瘤的恶性程度相关。上皮间质转化是导致胶质母细胞瘤侵袭特征的机制之一,其特点是上皮标志物(如E-钙黏蛋白)缺失和间充质标志物(如N-钙黏蛋白、β-连环蛋白)增加,被认为是胶质瘤侵袭性的重要调节因子[22]。推测RIOK2的过表达可能提高N-钙黏蛋白、β-连环蛋白的表达,使得肿瘤细胞向周围组织或远处扩散的能力增加,加剧癌症进程。Kaplan-Meier生存分析结果显示,RIOK2 mRNA高表达患者5年生存率低于RIOK2 mRNA低表达患者,RIOK2 mRNA高表达是脑胶质瘤患者5年内死亡的独立危险因素,且死亡组脑胶质瘤组织RIOK2 mRNA表达水平高于存活组,表明RIOK2高表达与脑胶质瘤患者不良预后相关。进一步ROC曲线分析结果显示,RIOK2 mRNA预测脑胶质瘤患者5年内死亡的AUC为0.711,而miR-4744和RIOK2 mRNA两者联合预测的AUC为0.885,提示两者联合预测脑胶质瘤患者预后的价值更高。

Gao等[9]报道称miR-4744可以与RIOK2的3'-非翻译区结合并负调控RIOK2的表达,且miR-4744对胶质瘤细胞的抑制作用可被RIOK2过表达逆转。本研究相关性分析显示,脑胶质瘤组织miR-4744与RIOK2 mRNA表达水平呈负相关,与其研究结果一致。

综上所述,miR-4744在脑胶质瘤组织中低表达,RIOK2 mRNA在脑胶质瘤组织中高表达,二者呈负相关,共同调控脑胶质瘤患者的病情进展,且miR-4744、RIOK2 mRNA联合对患者预后预测具有较高价值。但关于二者调控脑胶质瘤进展的机制仍需进一步研究。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

段升强:设计研究方案,实施研究过程,课题设计,论文撰写;乔建新:提出研究思路,分析试验数据,论文审核;徐新文:实施研究过程,资料搜集整理,论文修改;刘熙鹏、张秀峰:进行统计学分析