自噬在光疗治疗真菌性皮肤病中的研究进展

冯健婷　汤红峰

【摘要】 自噬被认为是机体的一种自我调节机制，对细胞和组织的动态平衡起着至关重要的作用。而真菌性皮肤病目前仍是当代社会备受关注的皮肤病之一。随着各种医学激光治疗的广泛应用，考虑到它全身副作用较小，便于使用，在治疗真菌感染性皮肤病方面的治疗中日益受到关注。现围绕自噬在光疗治疗各种真菌感染性皮肤病中的作用的相关研究展开综述。

【关键词】 真菌 自噬 氧化应激 氮化应激

Advances in the Study of Autophagy in Phototherapy of Fungal Skin Diseases/FENG Jianting， TANG Hongfeng. //Medical Innovation of China， 2023， 20（12）： -168

[Abstract] Autophagy is considered as a self-survival mechanism of the organism and plays a key role in the dynamic balance of cells and tissues. And fungal dermatoses are still one of the dermatological diseases that are of great concern in contemporary society. With the widespread use of various medical laser treatments， there is an increasing interest in the treatment of fungal infectious dermatoses given their low systemic side effects and ease of use. A review of studies related to the role of autophagy in the treatment of various fungal infectious dermatoses by phototherapy is presented.

[Key words] Fungi Autophagy Oxidative stress Nitrogenative stress

First-author's address： Guangdong Medical University， Zhanjiang 524023， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2023.12.039

皮肤真菌感染多数是病程长、难治愈、易复发的，尽管其在世界范围内发生率很高，但大部分发病机制仍然未知，治疗效果也不尽人意，特别是深部真菌病的治疗更为棘手。目前，真菌感染治疗主要通过口服或者外用抗真菌药及根据不同部位联合用药[1]。由于部分人因哺乳等特殊情况，在临床上难以有效地解决这些问题，其中最主要的原因是抗真菌药物种类的局限性[2]和耐药性的产生[3]。因此，有必要尋找其他安全、有效的治疗方法。光疗作为一种新的治疗手段已被广泛地应用于医学领域中。考虑到光疗具有全身副作用少、使用方便等特点，在真菌感染性皮肤病的治疗中日益受到关注。

由于利用光疗对深部真菌病的研究存在一定的难度，因此目前大多数研究重点都集中于浅部的致病真菌（皮肤癣菌）中，其最易侵害人畜的皮肤角质层，寄生在表皮角质、头发和甲板角蛋白组织，是浅表皮肤癣病的重要病因，偶尔会侵入深部组织，导致炎症反应和肉芽肿反应。由于深部真菌病发病率高于普通人，在免疫功能低下的人群中，尤其是儿童、老人、HIV、糖尿病及肿瘤化疗患者感染率升高，其中在免疫抑制患者中更为严重[4]。自噬一般由各种影响因素引起，例如饥饿、缺氧、氧化应激、病原体感染等。自噬机制被破坏会引发一系列包括肿瘤、神经退行性疾病、代谢相关疾病、免疫性疾病、微生物感染等方面的疾病。

1 光疗在真菌性皮肤病中的应用

近年来体内外研究证明光疗可以有效抑制真菌生长。Chen等[5]研究证实了亚甲蓝和发光二极管（LED）635 nm体外光动力对红色毛癣菌、须癣菌和石膏样毛癣菌的生物膜有一定的破坏性，使之对常规抗真菌药物变得更加敏感。Cronin等[6]单独使用LED 280 nm透过指甲在体外照射红毛癣菌后，培育两周后未发现真菌生长。Carmello等[7]也发现，无论是否使用光敏剂，使用蓝光（455 nm）均能体外损伤白色念珠菌的DNA。Calzavara-Pinton等[8]使用艾拉光动力疗法（ALA-PDT），艾拉，外用盐酸氨酮戊酸散，一种光敏剂，对9例由白色念珠菌、须癣菌、红色毛癣菌所致的难治性趾间真菌病进行治疗，取得了较好的疗效。Mang等[9]发现光动力疗法（PDT）可有效灭活从AIDS患者分离出来的耐两性霉素B和氟康唑的白色念珠菌。Sotiriou等[10]也报道了30例用ALA-PDT治疗的甲真菌病患者有43.3%的治愈率。白色念珠菌和红毛癣菌在PDT加入三种不同的水溶性光敏剂（孟加拉红、孔雀石绿草酸盐及亚甲蓝），加入了孟加拉红组的两种真菌生长程度明显得到抑制，加入尿素和硫脲可以增强甲板的渗透性，在治疗甲真菌病中有更好的疗效[11]。陆晟等[12]应用长脉宽1 064 nm Nd：YAG激光共治疗了79例甲真菌病患者，临床疗效率为67.1%，真菌学有效率为73.4%，复发或再感染率为19.0%。Kashiwabuchi等[13]研究发现长波紫外线（UVA）和核黄素联合处理酵母和丝状真菌，其形态和表型变化有一定的改变，缺乏一致性，对真菌灭活有一定的作用。这表明光疗可抑制各种真菌的生长，并且有望用于治疗真菌感染相关性皮肤病，尽管其作用机制尚不清楚。

2 应激刺激与真菌性皮肤病

过量的活性氧（ROS）产生可引起氧化应激（oxidative stress， OS），可导致细胞损伤和凋亡。文献[14-15]发现，用甲苯胺蓝作为光敏剂，在LED 630 nm下和红毛癣菌混合培养后，会被引起激活菌体自身杀灭作用，且ROS、过氧化亚硝酸根离子（ONOO-）、一氧化氮（NO）显著增加；而当波长为（417±5）nm的蓝光应用在作为光敏剂的姜黄素时，ROS也显著增加，抑制真菌生长。而Wi等[16]照射球形马拉色菌时，也可使菌量明显下降，ROS和脂质过氧化物显著增加。这提示不仅是PDT，仅来自可见光谱的光线也可导致自体光敏化过程，这可能是由于已经存在于细胞内有可充当光敏剂的生物膜或组织内的内源性物质的积累，导致在病原体中诱导产生ROS[17]。

真核生物中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase， NADPH oxidase， Nox）可以诱导ROS的产生，它不仅存在于哺乳动物细胞中，还存在于真菌、植物和其他真核生物中[18]。在真菌中，4种Nox的同系物被发现，分别是：NoxA、NoxB、NoxC和高铁还原酶（FRE）[19]。NoxA、NoxB和NoxC亚型与超氧化物产生有关，而FRE亚型则参与金属离子的产生[20]。真菌的Nox同系物与哺乳动物的Nox有序列相似性，它们也可以产生ROS，并被烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶抑制剂二苯基氯化碘盐（DPI）所抑制。Segmüller等[21]研究发现，NoxA和NoxB参与灰霉葡萄孢子菌的菌核形成。

NO也在不同生物体内具有多种重要作用，且真菌能够合成NO[22]。NO可以诱导性发育并影响构巢曲霉的形态发生，这部分可能通过自体产生的ROS起作用[23]。NO也被证明参与保护食用菌菌丝体免受由热应激诱导产生的氧化损伤[24]，但NO在过氧亚硝酸盐（ONOO-）及其质子化形式（ONOOH）、亚硝基过氧化碳酸盐（ONOOCO2-）和二氧化氮（NO2）细胞内过量累积会导致细胞产生各种活性氮（RNS），造成氮化应激爆发，导致细胞凋亡。哺乳动物细胞中自由基NO的主要来源是通过一氧化氮合酶（NOS）对L-精氨酸的酶氧化。虽然真菌中NO来源还没有完全研究清楚，但有研究显示哺乳动物NOS的抑制剂如N-硝基-L-精氨酸甲酯（Nω-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME）干预真菌也具有相似的抑制效果，提示真菌中也存在类似于哺乳动物的NOS[22，25]。单纯光疗在真菌治疗效果方面，目前还未见到关于NO作用方面的研究报道。

关于ROS和NO的相互作用，有研究表明NO往往会降低人类细胞中Nox1/2的表达，从而抑制ROS的产生[26]。与哺乳动物细胞内相反，在Chen等[27]的研究中，在芸苔属植物中加入硒，可以通过内源性NO的增加，上调还原型辅酶Ⅱ氧化酶从而触发植物内ROS爆发，引起毒性作用。另有研究发现，黄曲霉中加入麝香草酚可以使真菌中ROS和NO爆发，同时导致氧化应激和氮化应激，使真菌生长受到抑制，其中对麝香草酚的反应，NO的积累远低于ROS的积累，且起始时间比ROS明显延迟；麝香草酚存在时，用NADPH氧化酶抑制剂使ROS生成受阻，NO生成也同樣可以得到抑制，从而证明ROS是通过引起NO生成而参与麝香草酚引起真菌死亡[25]。研究表明单独强脉冲光（intense pulsed light，IPL）420 nm治疗红毛癣菌感染患者取得显著效果，说明IPL 420 nm可诱导ROS、NO产生，引发氧化损伤及氮化损伤的应激刺激，从而抑制了红毛癣菌的生长[28]。由此可见，ROS与NO在哺乳动物、植物及真菌中的相互关系各有不同，可能与物种或外界干预方式不同相关，NO和ROS可造成真菌损伤，但二者的相互关系尚未明确，有必要进一步探讨。

3 自噬与真菌感染性皮肤病的光疗

有文献表明应激与自噬存在一定的关系。细胞自噬，指真核生物对胞内大物质在进化上保守周转，在维持机体平衡中发挥着极大的作用的进化过程，通过降解细胞内受损或死亡的细胞器、异常蛋白等以维持正常的细胞功能。在此过程中，被双层膜结构的自噬小泡包裹的部分受损的蛋白质或细胞器形成自噬体，被送到溶酶体中，融合后形成自噬溶酶体进行降解并得以循环利用，以达到细胞稳态，并使细胞器不断更新。自噬分为巨自噬（macroautophagy），微自噬（microautophagy）和分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy，CMA）三种类型，其中巨自噬也就是人们常说的自噬。自噬体是指在细胞内形成并维持自身稳定形态的一种细胞器，具有清除受损蛋白质、抑制凋亡等多种功能，对机体起着非常重要的作用。而巨自噬分为选择性自噬（selective autophagy）和非选择性自噬（non-selective autophagy），依赖于其对于一些特定底物的选择性降解与否。非选择性自噬已得到了广泛研究，通常在特定条件下（如营养、饥饿）被诱导，用于长寿命蛋白质的大量降解[29]。选择性自噬包括细胞质-液泡靶向（Cvt）途径，过氧化物酶吞噬和线粒体自噬，通常靶向特定蛋白质或细胞器，由配体-受体-支架和Atg8蛋白家族组成受体蛋白复合物完成[30]。自噬发生的过程可大致分为4个部分：（1）接收自噬诱导信号之后，产生分隔膜，人微管相关蛋白轻链3Ⅱ（LC3-Ⅱ）在分隔膜的内膜和外膜均存在，其中LC3-Ⅱ作为细胞自噬过程中一个重要的标志蛋白已被报道[31]；（2）分隔膜继续延伸并融合，降解的底物与细胞质完全分离，形成自噬体；（3）自噬体与溶酶体的融合，形成自噬性溶酶体；（4）在多种水解酶的作用下，自噬体中的底物分子被分解成小分子，降解产物重新释放回细胞质内，得以循环利用[32]。到目前为止，在酵母中已经被发现有大约41个与自噬相关的蛋白，这些很多在真核生物域内都有高度的保守性。Klionsky等[33]将编码这些蛋白的基因统一命名为自噬相关基因（AuTophaGy，ATG），用以代表自噬基因及其相对应的蛋白质。

为了应对各种压力，严格控制降解过程，细胞自噬在促进丝状真菌的孢子形成、程序性细胞死亡、毒力及细胞存活方面起着重要作用，但目前真菌有关自噬的研究较少[34]，而有关光疗是如何影响丝状真菌的自噬过程更不明确。虽然国内外仍没有研究关于自噬是否参与光疗抑制真菌的作用过程，但可以推测，自噬在各种激光对真菌的抑制作用中也扮演着重要的角色，影响光疗的效果。

目前，已知PDT应用于肿瘤、感染性疾病等治疗，发生以下Ⅰ和Ⅱ型反应：在Ⅰ型反应中，光敏剂（PS）与生物分子之间的电子转移导致产生有害的反应中间体，如超氧阴离子（O2-），过氧化氢（H2O2）和羟基自由基（·OH）等活性氧成分。在Ⅱ型反应中，能量转移将PS激发成三态，产生单线态氧，它可以与一些生物分子如脂质和蛋白质反应。有研究发现，自噬在PDT抑制肿瘤细胞的过程中发挥重要作用。Wei等[35]发现通过药物抑制剂和Atg5基因沉默抑制自噬显著增加了PDT诱导的PROM1/CD133+含量，提示自噬具有抗凋亡的作用。Huang等[36]的研究中发现采用MPPa介导的光动力疗法（MPPa-PDT）诱导的MG-63细胞凋亡被3-甲基腺嘌呤（3-MA）和氯喹（CQ）预处理削弱，提示MPPa-PDT所致的自噬对MG-63细胞凋亡具有促进作用。上述结果符合Wang等[37]报道的抑制自噬可降低YM155诱导的前列腺癌细胞的凋亡，由此可见，细胞凋亡是具有自噬依赖性的。已有研究提示自噬可以通过ROS的断裂和凋亡的抑制来保护肿瘤细胞，而在某些情况下它可以使肿瘤细胞的自噬性死亡并促进肿瘤的抑制[38]。这提示自噬在PDT抗肿瘤作用中起双重作用。另外，根据Abe等[39]研究发现，3-MA，一种特定的早期自噬抑制剂减少了神经胶质瘤细胞（U251 MG）中毒素诱导的细胞死亡。另一方面，晚期自噬抑制剂CQ增加了诱导的细胞死亡。

4 总结

自噬是在自噬相关的基因调控下，受损的细胞器和大分子物质被溶酶体分解，以满足细胞本身的代谢需求及某些细胞器进行更新和修复的目的。由于激光疗的广泛应用，在不同层面广受患者好评。但光疗在真菌性皮肤病方面目前仍是个崭新的研究领域，而自噬在真菌感染方面相关机制的探讨亦是相对较少。故开展自噬在真菌性皮肤病治療方面的相关研究，特别是光疗，将有助于寻找到真菌感染性疾病新的治疗靶点，从而为激光广泛应用于真菌感染性疾病的治疗提供新的思路。

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（收稿日期：2023-03-06） （本文編辑：张明澜）