FOXP3减少瘢痕疙瘩成纤维细胞的胶原分泌及相关机制初探

邓雨萌 岑蕊言 王利群 何咏磬 杨桂红 邓军 赵艳 唐辉 雷霞

（Keloid fibroblasts，KFB）中叉头样转录因子3（Forkhead-like transcription factor 3，FOXP3）对真皮胶原蛋白沉积及纤维化的影响及相关机制。方法：免疫组化检测瘢痕疙瘩组织中I型胶原蛋白（Collagen type I，COL1）、Ⅲ型胶原蛋白（Collagen type Ⅲ，COL3）、IL-6、TGF-β1、FOXP3的表达。体外分离培养KFB，并采用腺病毒过表达FOXP3或给予TGF-β1抑制剂处理。通过Western blot检测对照组、过表达组以及对照组和抑制剂组的COL1、COL3的表达，ELISA检测TGF-β1、IL-6的表达，Masson染色观察胶原沉积情况。结果：与对照组相比，实验组中的COL1、COL3、IL-6、TGF-β1蛋白水平升高，FOXP3蛋白水平降低。经过表达FOXP3或TGF-β1抑制剂处理后，KFB的TGF-β1和IL-6表达降低，胶原蛋白沉积减少。结论：在KFB中FOXP3可能通过抑制TGF-β1的表达，减少组织纤维化和胶原蛋白沉积。

[关键词]瘢痕疙瘩；成纤维细胞；叉头样转录因子3；转化生长因子-β1；胶原沉积

[中图分类号]R751.05    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2023）05-0090-05

A Preliminary Investigation on the Reduction of Collagen Secretion by FOXP3 in Keloid Fibroblasts and Related Mechanisms

DENG Yumeng1，CEN Ruiyan1，WANG Liqun1，HE Yongqing1，YANG Guihong1，DENG Jun2，

ZHAO Yan3，TANG Hui1，LEI Xia1

（1.Department of Dermatology，Daping Hospital Army Medical University，Chongqing 400042，China; 2.Department of Dermatology，Chongqing MINE Medical Beauty Hospital，Chongqing 401121，China; 3.Department of Army Occupational Disease，Daping Hospital，Army Medical University，Chongqing 400042，China）

Abstract： Objective  To investigate the effect of Forkhead-like transcription factor 3 （FOXP3） on dermal collagen deposition and fibrosis in keloid fibroblasts（KFB）and related mechanisms. Methods  Immunohistochemistry was performed to detect the expression of Collagen type I （COL1）， Collagen type III （COL3）， IL-6， TGF-β1， and FOXP3 in keloid tissues. KFB were isolated and cultured in vitro and treated with adenoviral overexpression of FOXP3 or given TGF-β1 inhibitors. The expression of COL1 and COL3 in control and overexpression groups as well as control and inhibitor groups were detected by Western blot， TGF-β1 and IL-6 by ELISA， and collagen deposition was observed by Masson staining. Results  Compared with the control group， the levels of COL1， COL3， IL-6， and TGF-β1 proteins were increased and FOXP3 protein levels were decreased in the experimental group. After treatment with expression of FOXP3 or TGF-β1 inhibitor， TGF-β1 and IL-6 expression in KFB was decreased and collagen deposition was reduced. Conclusion  In KFB FOXP3 may reduce tissue fibrosis and collagen deposition by inhibiting the expression of TGF-β1.

Key words： keloid; fibroblast; forkhead-like transcription factor 3; transforming growth factor β1; collagen deposition

瘢痕疙瘩系皮膚损伤后结缔组织高度增生引起的疾病，病理特征为真皮层胶原蛋白过度沉积和持续的局部炎症[1]。该病复发率高，严重影响患者的生活质量。成纤维细胞通过分泌COL1和COL3等来促进组织修复，但过度分泌的胶原蛋白是组织纤维化的一个重要因素。此外，慢性炎症与免疫失调也能导致组织纤维化的发生[2]，如：炎症指标IL-6的表达与纤维化成正比[4]。

既往研究表明，瘢痕疙瘩中的成纤维细胞基本处于未成熟状态，能高度增殖[4]，并分泌过多的胶原蛋白，且TGF-β/SMAD（转化生长因子-β/白细胞抑制因子信号通路）通路被过度激活。TGF-β1代表纤维化的程度，由Treg（调节性T细胞）和成纤维细胞等产生[5]。与此同时，Treg分泌的FOXP3可通过介导Treg的抑制功能来调控TGF-β1的表达[6]。FOXP3可由多种细胞分泌，如Treg细胞、肿瘤组织细胞、非造血干细胞等[7]，但KFB是否表达并未见报道。不同组织FOXP3的分泌量也不尽相同。比较特别的是，在瘢痕疙瘩组织中，由于局部免疫失调，FOXP3的分泌量明显降低[8]。在瘢痕疙瘩的既往研究中发现[9]将KFB与含35%Treg细胞的混合T细胞群共培养后发现胶原合成明显减少。本研究拟探索KFB中FOXP3的表达情况，并通过在KFB中过表达FOXP3来探讨其对真皮胶原蛋白沉积及纤维化的影响及相关机制。

1  资料和方法

1.1 临床资料

1.1.1 实验组：组织标本均来源于2018年9月-2022年8月在重庆市玛恩皮肤医院就诊并行手术治疗的30例瘢痕疙瘩患者，其中男11例，女19例，平均年龄（29.43±10.12）岁，病程1～5年。纳入标准为1992年Darzi诊断标准[9]，年龄20～50岁。以上组织均由HE染色并诊断。

1.1.2 对照组：选择30例在重庆市玛恩皮肤医院因外伤切除的正常皮肤组织以及行包皮环切术后的正常包皮组织患者，其中男11例，女19例，平均年龄（35.46±10.12）岁。纳入标准为无其他系统疾病以及未患其他皮肤病的成年患者，年龄20～50岁。所有患者均签署知情同意书，且本实验已通过伦理委员会审批，原则符合《赫尔辛基宣言》。

1.2 方法

1.2.1 实验试剂：免疫组化试剂盒、DAB显色液（北京中杉金桥生物）；cck-8试剂、全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒、青霉素、链霉素（上海碧云天生物）；FBS（胎牛血清）（VivaCell，中国上海）；COL1、COL3、TGF-β1、FOXP3、IL-6、GAPDH（三磷酸甘油醛脱氢酶）一抗（Abcom，美国）；vimentin一抗（CST，美国）；Masson三色染色试剂盒（北京索莱宝科技）；Ad-FOXP3（FOXP3过表达腺病毒）（上海汉恒生物）；ly2157299，APExBIO；IL-6、TGF-β1因子ELISA试剂盒（武汉博士德生物）；水凝胶原液（陆军特色医学中心口腔科配置并惠赠）。

1.2.2 KFB细胞分离、培养及鉴定：术后的瘢痕疙瘩组织经75%酒精消毒、PBS清洗后剪成0.1 cm2左右的组织块，在5 mg/ml的中性蛋白酶中4℃消化过夜，次日剥离组织表皮，剪碎剩余的真皮组织，再加入3 mg/ml的I型胶原酶消化2 h，1 500 rpm，离心5 min，将细胞沉淀用高糖DMEM（含10%FBS+青霉素、链霉素）培养基重悬并接种在细胞培养瓶中，每3 d换液，细胞融合率达90%左右传代[11]。2～5代细胞用于后续实验。KFB采用波形蛋白（Vimentin）进行鉴定。

1.2.3 免疫组化实验：①组织免疫组化：手术取得的瘢痕疙瘩组织与正常皮肤组织经4%多聚甲醛固定48 h后，按常规方法制成石蜡块，随后切片，参照SP法进行[12]免疫组化检测，检测抗体为COL1、COL3、IL-6、TGF-β1、FOXP3；②KFB细胞免疫组化：细胞常规消化后计数，以2×105/ml的密度接种到12孔板中行细胞爬片，24 h后4%多聚甲醛固定48 h，后续按上述SP法进行，检测抗体为Vimentin、TGF-β1、FOXP3。

1.2.4 Western blot：探索Ad-FOXP3的最佳MOI（感染复数）值以及TGF-β抑制剂ly2157299的最佳抑制浓度，分别处理后，提取细胞蛋白行Western blot实验，测得处理后的KFB中的FOXP3、COL1、COL3蛋白表达，结果经Image J软件分析计算蛋白的相对表达量。

1.2.5 IL-6、TGF-β1因子ELISA实验：Ad-FOXP3和ly2157299分别处理KFB后，收集上清液，按照准备样品、抗体反应、洗板、显色、终止反应的步骤行ELISA实验，观察IL-6、TGF-β1的表达情况。

1.2.6 Masson三色染色：Ad-FOXP3和ly2157299分别处理KFB，以5×105的细胞密度接种到水凝胶中继续培养48 h，常规方法制作成蜡块，切片行Masson染色。观察处理前后胶原蛋白的表达分泌。

1.3 统计学分析：采用SPSS 8.0软件进行统计学分析，GraphPad Prism 8软件画图，计量资料用（x?±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间采用单因素方差分析，如数据不符合正态性及方差齐性，则使用非参数检验。P＜0.05表示结果具有统计学意义。

2  结果

2.1 两组组织中胶原蛋白和IL-6的表达：免疫组化染色显示，COL1、COL3与IL-6均表达于瘢痕疙瘩的真皮层，且实验组COL1、COL3与IL-6的阳性率分别为（29.53±3.52）%、（17.67±3.14）%、（15.80±3.32）%，均显著高于对照组的（13.39±2.04）%、（5.06±1.34）%、（4.80±1.66）%，差异均具有极显著统计学意义（P＜0.0001）。表明瘢痕疙瘩组真皮组织中COL1、COL3与IL-6表达明显升高。见图1。

2.2 瘢痕疙瘩组织和KFB中FOXP3和TGF-β1的表达：TGF-β1和FOXP3在瘢痕疙瘩组织中的表达情况如图2A、B所示，TGF-β1、FOXP3均在瘢痕疙瘩组织的真皮层显示阳性。与对照组相比，实验组的TGF-β1的阳性率为（15.94±2.83）%，显著高于对照组（4.67±1.44）%，差异均具有极显著统计学意义（P＜0.0001）。而FOXP3实验组的阳性率为（1.84±0.44）%，显著低于对照组（8.45±0.87）%，差异均具有极显著统计学意义（P＜0.0001）。体外培养的KFB行Vimentin染色后，所有的细胞质均呈现阳性，证明所提取的KFB为成纤维细胞（见图2C）。TGF-β1和FOXP3在KFB中的表达情况如图2D所示，TGF-β1、FOXP3在KFB的胞质中均呈阳性，表明KFB中有TGF-β1和FOXP3表達。

2.3 過表达FOXP3后KFB中胶原蛋白、TGF-β1和IL-6的表达：采用腺病毒感染KFB使其过表达FOXP3并使用免疫荧光探的最佳MOI值（见图3A），然后用ELISA检测TGF-β1、IL-6的表达情况如图3B所示，过表达组TGF-β1的含量为（366.50±118.20）pg/ml、IL-6的含量为（26.21±4.38）pg/ml，均显著低于对照组的TGF-β1含量（670.30±112.70）pg/ml、IL-6含量（47.93±7.82）pg/ml，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。证实TGF-β1、IL-6的分泌下降。过表达FOXP3后KFB的胶原蛋白表达情况如图3C、D所示，过表达组中两种胶原蛋白的表达量均显著低于对照组，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。将过表达处理后的KFB制作成水凝胶后行Masson染色，从图3E、F可见，过表达组中显示胶原纤维的蓝色区域较对照组明显减少，进一步验证了Western blot的实验结果。

2.4 ly2157299抑制TGF-β1后KFB中IL-6以及胶原蛋白的表达：在KFB中加入TGF-β1抑制剂ly2157299，先用CCK-8探的不同抑制浓度下的细胞的存活（见图4A）。ELISA检测结果显示，TGF-β1、IL-6随着抑制剂浓度增加表达量逐渐下降，TGF-β1在KFB、1μM抑制剂组、2μM抑制剂组、3μM抑制剂组的表达量分别为（245.20±23.16）pg/ml、（209.30±52.18）pg/ml、（208.20±37.36）pg/ml、（132.30±24.41）pg/ml；IL-6在KFB、1μM抑制剂组、2μM抑制剂组、3μM抑制剂组的表达量分别为（666.20±24.34）pg/ml、（640.70±11.74）pg/ml、（585.70±41.64）pg/ml、（133.00±25.44）pg/ml（见图4D）。Western blot证实胶原蛋白的表达下降（见图4B、C），水凝胶Masson染色实验中观察结果胶原蛋白的沉积，蓝色区域即胶原纤维随着抑制剂浓度的增加逐步减少，与Western blot结果一致（见图4E、F）。

3  讨论

瘢痕疙瘩作为一种复发率高的疾病，在给患者生活带来影响的同时也造成了心理负担。其形成的作用机制主要是TGF-β/SAMD通路的过度活化，促进了纤维化及胶原蛋白的沉积[13]。此外，瘢痕疙瘩中慢性炎症的持续存在也促进了该病持续不断的纤维化和胶原蛋白沉积[14]，同时累及周围正常皮肤表现出“瘢痕疙瘩化”现象[15]。

FOXP3作为Treg细胞的一个重要分泌蛋白，在瘢痕疙瘩中的表达显著下降，这种异常的低表达提示其在发病中可能发挥重要作用，值得进一步研究。FOXP3可以调节许多免疫效应，当它的表达下降时会抑制Treg细胞的分化[16]，这种异常作用的Treg细胞会进一步激活成纤维细胞使其过度增殖[17]。所以我们推测，瘢痕疙瘩成纤维细胞的过度增殖可能与Treg细胞分泌的FOXP3含量相关。且前文也提到FOXP3能够调控TGF-β1的分泌，那么在瘢痕疙瘩成纤维细胞中是否也有同样的调控作用，这需要进一步研究来进行证实。从组织的免疫组化实验结果可知，瘢痕疙瘩中FOXP3的表达是明显下降的，故而进一步推断，FOXP3的低表达可能是影响成纤维细胞分泌胶原蛋白的原因之一。从分子层面上来讲，在瘢痕形成中作为重要因子的TGF-β1主要由成纤维细胞分泌，过度增殖的成纤维细胞会产生较多的TGF-β1因子，在激活炎症反应的同时也以自分泌的方式产生更多的TGF-β1[18]，同时炎症反应的激活也能够进一步导致纤维化的产生，成为瘢痕疙瘩持续存在的一个原因。从发病机制上来说，TGF-β1的不断产生，也使得其过度活化，导致局部免疫失调，在TGF-β/SMAD信号通路上不断传导TGF-β1的信号以产生更多的胶原蛋白[19]。抑制TGF-β1的不断产生则可以抑制成纤维细胞的胶原分泌，从本次实验结果中可知，过表达FOXP3可以抑制TGF-β1因子的过度活化，并抑制炎症因子IL-6的产生，阻止KFB过多地分泌胶原蛋白，从而抑制纤维化。

综上，通过本研究证实，过表达FOXP3很可能通过抑制TGF-β1通路活化从而减少胶原蛋白沉积和炎症因子IL-6的表达，但是是否能作用于TGF-β/SAMD通路，并影响SMAD相关因子的表达，则需要进一步进行研究，同时该实验的发现为治疗瘢痕疙瘩提供一个思路，在局部过表达FOXP3后可以减少瘢痕疙瘩内胶原蛋白的沉积以及炎症因子的表达，这在以后的治疗中可能会成为一个新的靶点。

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[收稿日期]2022-09-21

本文引用格式：邓雨萌，岑蕊言，王利群，等.FOXP3减少瘢痕疙瘩成纤维细胞的胶原分泌及相关机制初探[J].中国美容医学，2023，32（5）：90-95.