罗哌卡因对骨肉瘤细胞增殖、侵袭及雷帕霉素靶蛋白/缺氧诱导因子1α信号通路的影响

张素冰,高 辉,赵滨滨,张丹琦

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院麻醉手术科,黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学附属第三医院麻醉手术科,黑龙江 哈尔滨 150040)

骨肉瘤是一种恶性梭形细胞肿瘤,具有不成熟的骨样组织,好发于青少年,疾病引发的疼痛症状会被误认为是成长引起的,在性别发病率上男性远多于女性[1-2]。骨肉瘤具有恶性程度强、侵袭、转移快且早的特点,具有较高致死率,患者预后差,即使手术切除后仍有复发与远处转移风险,长期生存率无显著提高[3]。因此,治疗药物的进一步筛选及相关信号通路机制的探索仍是临床研究的热点。罗哌卡因是临床麻醉、镇痛类药物,属于左旋长效酰胺类药物。研究[4-5]认为手术途中使用麻醉药物对降低乳腺癌、食管鳞癌等癌症复发有帮助。朱婧等[6]研究认为罗哌卡因可降低胃癌细胞(MGC-803)增殖并阻滞细胞周期。有关罗哌卡因对骨肉瘤的作用还未研究,罗哌卡因是否会对骨肉瘤细胞增殖与转移有影响?本研究将对此展开研究。雷帕霉素靶蛋白(Rapamycin target of rapamycin,mTOR)是骨肉瘤经典致癌通路之一,其激活可调控下游靶基因参与对肿瘤进程的影响[7]。缺氧诱导因子1α(Hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)在胃癌[8]、肺癌[9]等多种肿瘤中存在高表达,肿瘤细胞恶性增殖会导致体内氧缺失,此环境下促使HIF-1α水平升高,为肿瘤细胞提供生长环境,促进肿瘤的转移,其亦是mTOR的关键下游因子[10]。基于此,本研究探讨罗哌卡因对骨肉瘤细胞的影响及其与mTOR/HIF-1α通路的关系,为骨肉瘤治疗的药物及通路研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要细胞与试剂 MG63细胞(CL-0157)购自普诺赛公司;罗帕卡因(T54853)购自上海源叶公司;Ki-67(ab21700)、基质金属蛋白酶2(MMP-2,ab92536)、MMP-9(ab283575)、mTOR(ab32028)、HIF-1α(ab51608)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH,ab9485)抗体、羊抗兔IgG二抗(ab6721)购自美国Abcam公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及MG63细胞增殖抑制率检测:常规培养人骨肉瘤MG63细胞并传代处理。取对数生长期的MG63细胞,以每孔2×104个细胞数的密度在96孔板中接种,分别加入终浓度为0、2.5、5、12、25、50、100、200、400 μg/ml的罗哌卡因溶液[6](DMEM培养基稀释)。48 h后,每孔加入100 μl CCK-8试剂(避免气泡生成)。孵育2 h后,测定450 nm处吸光值,检测MG63细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.2 MG63细胞分组:将对数期MG63细胞分为对照组、罗哌卡因低浓度组、罗哌卡因中浓度组、罗哌卡因高浓度组。对照组细胞常规培养。罗哌卡因低、中、高浓度组分别在培养基中加入50、100、200 μg/ml浓度的罗哌卡因。

1.2.3 MG63细胞平板克隆率检测:收集1.2.2中四组MG63细胞,按照每孔200个细胞密度在24孔板中接种,在37 ℃、5% CO2培养箱内培养14 d,注意及时更换培养液(每3 d换液1次)。培养结束后对细胞固定(多聚甲醛)并染色(1%结晶紫),PBS冲洗干净后拍照。克隆形成率=克隆细胞数/接种细胞数×100%。

1.2.4 MG63细胞Ki-67表达检测:将适量MG63细胞在24孔板中接种,PBS洗涤3次,多聚甲醛(4%)固定细胞,过氧化氢浸泡10 min,PBS洗涤后封闭,加入稀释的Ki-67抗体(PBS稀释,1∶100)孵育过夜。洗涤后加入山羊抗鼠二抗,37 ℃孵育1 h,PBS溶液洗涤,加入DAB显色,苏木精复染。经分化、透明、封片后,显微镜下观察染色情况。选取5个独立视野,计数阳性细胞数(黄褐色)。Ki-67阳性率=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.5 MG63细胞侵袭、迁移能力检测:侵袭实验中,将Matrigel胶加入Transwell小室,37 ℃条件下进行3 h固化,并加入5×104个MG63细胞。将500 μl DMEM培养基添加到下室中,培养箱孵育24 h。多聚甲醛(4%)固定,结晶紫染色20 min,PBS洗涤2次,拍照并观察MG63细胞侵袭数目。迁移实验中,Transwell小室中不加入Matrigel胶,其余操作同侵袭实验。

1.2.6 MG63细胞MMP-2、MMP-9、mTOR、HIF-1α蛋白表达检测:收集各组MG63细胞,按照每孔3×106个细胞数量接种于24孔板中,37 ℃、5% CO2培养箱中培养,24 h后采用BCA蛋白试剂盒对蛋白质定量。SDS-PAGE分离蛋白质,转移至PVDF上(湿转法),封闭1 h,添加MMP-2(1∶1000)、MMP-9(1∶1000)、mTOR(1∶1000)、HIF-1α(1∶1000)、GAPDH(内参,1∶5000),孵育过夜。洗涤后添加羊抗兔IgG(1∶5000)2 h。ECL显影,测定蛋白灰度值。

2 结 果

2.1 罗哌卡因对骨肉瘤细胞增殖的影响 0、2.5、5、12、25、50、100、200、400 μg/ml浓度的罗哌卡因作用于MG63细胞后,对MG63细胞增殖抑制情况不同。当罗哌卡因浓度≤25 μg/ml时,MG63细胞增殖抑制率均<90%;当罗哌卡因浓度≥50 μg/ml时,MG63细胞增殖抑制率显著升高,且随罗哌卡因浓度升高,增殖抑制率呈上升趋势(P<0.05);当罗哌卡因浓度为100 μg/ml时,细胞增殖抑制率接近50%。因此,本研究分别选取50、100、200 μg/ml的罗哌卡因作为后续处理的低、中、高浓度。

2.2 罗哌卡因对MG63细胞克隆形成率的影响 见图1。对照组及罗哌卡因低、中、高浓度组MG63细胞克隆形成率依次为(44.32±6.33)%、(31.53±4.50)%、(22.02±3.14)%和(13.52±1.93)%。与对照组比较,罗哌卡因低、中、高浓度组MG63细胞克隆形成率降低(均P<0.05)。与罗哌卡因低浓度组比较,罗哌卡因中、高浓度组MG63细胞克隆形成率降低(均P<0.05)。与罗哌卡因中浓度组比较,罗哌卡因高浓度组MG63细胞克隆形成率降低(P<0.05)。

图1 四组MG63细胞平板克隆实验结果(结晶紫染色)

2.3 罗哌卡因对Ki-67的影响 见图2。对照组及罗哌卡因低、中、高浓度组MG63细胞Ki-67阳性率依次为(46.72±7.72)%、(25.43±4.25)%、(17.24±3.05)%和(8.16±1.36)%。与对照组比较,罗哌卡因低、中、高浓度组Ki-67阳性率降低(均P<0.05)。与罗哌卡因低浓度组比较,罗哌卡因中、高浓度组MG63细胞Ki-67阳性率降低(均P<0.05)。与罗哌卡因中浓度组比较,罗哌卡因高浓度组MG63细胞Ki-67阳性率降低(P<0.05)。

图2 四组MG63细胞Ki-67免疫组化染色结果(×200)

2.4 罗哌卡因对MG63细胞侵袭和迁移的影响 见表1(图3)。与对照组比较,罗哌卡因低、中、高浓度组MG63细胞侵袭细胞数和迁移细胞数降低(均P<0.05)。与罗哌卡因低浓度组比较,罗哌卡因中、高浓度组MG63细胞侵袭细胞数和迁移细胞数降低(均P<0.05)。与罗哌卡因中浓度组比较,罗哌卡因高浓度组MG63细胞侵袭细胞数和迁移细胞数降低(P<0.05)。

表1 四组MG63细胞侵袭细胞数和迁移细胞数比较(个)

图3 四组MG63细胞Transwell实验结果(结晶紫染色,×100)

2.5 罗哌卡因对MG63细胞侵袭相关蛋白的影响 见表2。与对照组比较,罗哌卡因低、中、高浓度组MG63细胞MMP-2和MMP-9蛋白表达降低(均P<0.05)。与罗哌卡因低浓度组比较,罗哌卡因中、高浓度组MG63细胞MMP-2和MMP-9蛋白表达降低(均P<0.05)。与罗哌卡因中浓度组比较,罗哌卡因高浓度组MG63细胞MMP-2和MMP-9蛋白表达降低(均P<0.05)。

表2 四组MG63细胞MMP-2和MMP-9表达比较

2.6 罗哌卡因对MG63细胞mTOR/HIF-1α通路的影响 见表3。与对照组比较,罗哌卡因低、中、高浓度组MG63细胞mTOR和HIF-1α蛋白表达降低(均P<0.05)。与罗哌卡因低浓度组比较,罗哌卡因中、高浓度组MG63细胞mTOR和HIF-1α蛋白表达降低(均P<0.05)。与罗哌卡因中浓度组比较,罗哌卡因高浓度组MG63细胞mTOR和HIF-1α蛋白表达降低(均P<0.05)。

表3 四组MG63细胞mTOR/HIF-1α通路蛋白比较

3 讨 论

骨肉瘤是严重威胁青少年生存期与生存质量的骨性癌症[11]。手术切除与化疗联合治疗是骨肉瘤的常规治疗手段,实现保肢抑癌作用。麻醉药物可发挥对癌细胞的抑制作用已经过大量实验验证。例如,2、10、50 ng/ml舒芬太尼均可抑制宫颈癌细胞增殖与转移[12];丙泊酚可通过对miR-133a的调控参与对乳腺癌细胞增殖与侵袭的抑制[13];异丙酚抑制Wnt/β-catenin通路抑制乳腺癌细胞增殖[14]。

罗哌卡因是氨基酰类麻醉药,在临床中主要用分娩、术后镇痛[15-16]。除镇痛作用外,罗哌卡因也可发挥对癌细胞的抑制作用。陈颖等[17]研究显示,罗哌卡因可通过抑制癌细胞线粒体呼吸作用,剂量依赖性地抑制人甲状腺癌细胞增殖,并诱导甲状腺癌细胞凋亡。张挚等[18]研究显示,罗哌卡因可作用于乳腺癌肿瘤微环境,发挥对乳腺癌转归的影响,提高乳腺癌患者的生存时间。本研究选取0～400 μg/ml浓度的罗哌卡因作用于MG63细胞,发现0～25 μg/ml的罗哌卡因不对MG63细胞产生明显增殖抑制作用,当罗哌卡因浓度高于25 μg/ml时,MG63细胞的增殖抑制率逐渐升高,即一定浓度的罗哌卡因可抑制MG63细胞增殖,因罗哌卡因浓度为100 μg/ml时细胞增殖抑制率接近50%,因此选取50、100、200 μg/ml的罗哌卡因作为研究浓度。本研究显示,低、中、高浓度的罗哌卡因均可降低MG63细胞克隆形成率,抑制MG63细胞的增殖潜力,影响MG63细胞对生存环境的适应性。骨肉瘤的高转移性是患者术后易复发的关键原因,其高转移性与肿瘤细胞的侵袭、转移能力有关,因此治疗药物的抑制侵袭转移能力是重要特征之一,本研究中经低、中、高浓度的罗哌卡因处理后,MG63细胞的侵袭细胞数和迁移细胞数均降低,即罗哌卡因具有抑制MG63细胞转移的能力。Ki-67是增殖相关抗原,与细胞的有丝分裂有关,在肿瘤的恶性增殖中不可或缺,本研究通过免疫组化法检测不同组别间Ki-67表达情况,发现经罗哌卡因处理后MG63细胞Ki-67阳性率降低,进一步说明了罗哌卡因可抑制MG63细胞增殖。MMP-2和MMP-9是重要的肿瘤细胞侵袭转移蛋白,可降解细胞外基质,破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障,在肿瘤浸润中发挥关键作用。本研究中罗哌卡因处理后MG63细胞MMP-2和MMP-9蛋白水平显著下降,提示罗哌卡因可降低MG63细胞的侵袭能力。

肿瘤细胞的恶性增殖往往伴随环境内氧缺失,氧缺失会导致HIF-1α水平升高,因此胃癌、肺癌等多种肿瘤组织中可见HIF-1α水平升高。mTOR是HIF-1α的关键上游,参与多种癌症的经典致癌途径,可整合多种细胞外信号刺激,从而调节细胞功能,骨肉瘤中可见mTOR通路的激活。王华磊等[19]研究认为,雷帕霉素通过mTOR/HIF-1α通路调控人骨肉瘤细胞凋亡。Rathore等[20]认为,靶向mTOR是治疗骨肉瘤的新方法。本研究中,经罗哌卡因处理后,MG63细胞mTOR和HIF-1α水平均降低,提示罗哌卡因可抑制mTOR/HIF-1α通路的激活。

综上所述,罗哌卡因可抑制MG63细胞增殖、侵袭、转移,并可抑制mTOR/HIF-1α通路的激活。但本研究仅探讨了罗哌卡因与mTOR/HIF-1α的关系,罗哌卡因是否能通过mTOR/HIF-1α参与对MG63细胞的调控仍未可知,下一步将对此展开探讨。