肉苁蓉苯乙醇苷调控GSK3β/Nrf2/ARE通路减轻脑中动脉梗死大鼠氧化应激损伤实验研究

李 亮,蒋晓帆,李 侠,张 婵,余 良

(空军军医大学西京医院,陕西 西安 710032)

近年来,脑血管疾病患病率逐年上升,已成为全球60岁以上人口死亡的第二大原因,其中缺血性脑卒中约占60%～80%[1]。目前临床尚缺乏有效的治疗手段,患者发病后常遗留神经功能障碍,对其身心健康和生活质量造成严重影响[2]。氧化应激反应在缺血性脑病发病过程中发挥重要作用,脑组织缺血缺氧后,局部自由基显著增多,而抗氧化酶的功能降低,引起脑血管和神经细胞损伤,此时通过调动机体内源性抗氧化系统清除增多的自由基可有效抑制脑组织损伤进展[3]。肉苁蓉苯乙醇苷是从肉苁蓉中提取的一类苯乙醇苷类化合物,具有较强的抗氧化活性,研究[4]发现其可通过抑制低氧下脑组织的氧化应激反应修复脑损伤。研究[5-6]显示,糖原合成酶激酶3β(Glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)/核因子E2相关因子2(Nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2)/抗氧化反应元件(Antioxidant response element,ARE)信号通路与缺血性脑卒中的发生、发展关系密切,通过靶向调节该信号通路可有效减轻脑组织氧化应激损伤。基于此,本实验通过诱导脑中动脉梗死(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠模型探究肉苁蓉苯乙醇苷干预MCAO大鼠氧化损伤的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠100只,购于空军军医大学实验动物中心[合格证编号:SCKX(陕)2019-001号],体重(200±20)g。实验前1周于SPF级动物房适应性饲养,温度保持(23±3)℃,相对湿度40%～70%。

1.2 主要试剂 肉苁蓉苯乙醇苷(批号:20210701,九江华汉生物科技有限公司);尼莫地平(批号:220814,山东新华制药公司);2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)试剂(北京索莱宝科技公司);大鼠超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)ELISA试剂盒(南京森贝伽生物科技公司);Nissl染色试剂盒(上海生工生物工程公司);抗-GSK3β、Nrf2、血红素氧化酶-1(HO-1)、GAPDH(Santa Crutz公司);GSK3β、Nrf2、HO-1、GAPDH基因引物(上海捷瑞生物工程公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 分组与干预:动物称重后按体重高低依次分笼,随机分为假手术组、模型组、阳性对照组、肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组和肉苁蓉苯乙醇苷高剂量组,每组20只。通过大脑中动脉线栓法制备MCAO模型[7]:大鼠腹腔注射水合氯醛(按400 mg/kg)麻醉后,于颈正中部做一切口,并沿切口分离暴露左颈总动脉及颈内、外动脉,结扎颈总、颈外动脉,在颈总动脉近分叉处放置一根手术线,随后于分叉处剪一切口,从切口处插入线栓以阻断中动脉血供。线栓于颈总动脉插入颈内动脉,前进约18～20 mm可感到阻力,随后逐层缝合切口,假手术组仅分离上述血管而不予结扎。缺血再灌2 h后,阳性对照组给予尼莫地平(12 mg/kg);肉苁蓉苯乙醇苷低、高剂量组分别给予肉苁蓉苯乙醇苷150、300 mg/kg,每日灌胃1次,共14 d;假手术组及模型组给予等体积0.9%氯化钠溶液灌胃。

1.3.2 神经功能评定:分别于造模及治疗结束后评价大鼠神经功能缺损情况[8]。1～4分为实验纳入标准,将不符合模型评定标准的大鼠剔除。0分指活动无异常,未见肢体神经功能损伤表现;1分指肢体神经功能轻微缺损,提尾悬吊时不能充分伸展缺血侧前肢;2分指肢体神经功能中度缺损,爬行时向对侧转圈、追尾;3分指肢体神经功能重度缺损,行走时向对侧倾斜;4分指意识丧失,不能自发行走。

1.3.3 脑含水量检测:大鼠按400 mg/kg剂量腹腔注射水合氯醛后断头取脑,采用电子分析天平立即称取脑组织湿重,之后放入60 ℃烘箱烘烤72 h,再次称重,反复称至2次重量差<0.3 mg,得到脑组织干重[9]。根据干湿重之比,按(湿重-干重)/湿重×100%计算脑含水量。

1.3.4 脑梗死占比检测:大鼠按400 mg/kg剂量腹腔注射水合氯醛后断头取脑,将脑组织于-20 ℃速冻20 min左右取出,放于切片板上间隔2 mm做连续冠状切片,共计5片。切片放入2% TTC溶液,避光均匀染色30 min(37 ℃)。取出组织,PBS冲洗3次后用4%多聚甲醛固定24 h。正常组织染色后为红色,苍白及未着色区即为脑梗死区。染色结束后,整齐排列各组大脑切片并拍照,采用Image Pro 软件处理图像,测算每个脑片梗死面积。脑梗死占比=脑梗死面积/脑切片面积×100%。

1.3.5 海马神经元形态观察:大鼠按400 mg/kg剂量腹腔注射水合氯醛后,快速开胸暴露心脏,取输液针从左心进针,使针尖穿入左心室,随即找准主动脉弓,穿入主动脉,缓慢注射0.9%氯化钠溶液后灌注PBS固定液(含4%多聚甲醛),1 h后断头取脑并于4%多聚甲醛中4 ℃固定72 h。分离海马组织石蜡切片(5 μm厚)并脱蜡,乙醇梯度脱水,行Nissl染色后封片,显微镜下观察海马CA1区神经元形态。

1.3.6 血清MDA、SOD、GSH-Px水平检测:各组大鼠于治疗结束后经腹主动脉采血,3000 r/min离心分离血清,分装保存于-20 ℃冰箱备用。采用ELISA法检测血清中SOD、GSH-Px、MDA水平。血清临用前置于室温平衡1 h,3000 r/min 离心20 min后吸取上清,分别设空白孔、标准孔、样品孔,样品孔加样品稀释剂40 μl、血清样品10 μl及辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗100 μl,37 ℃恒温箱温育30 min。经洗涤后加入显色液,37 ℃避光温育15 min,加终止液50 μl,酶标检测仪于450 nm处测定各孔溶液OD值,按标准孔OD值绘制标准曲线,代入各样本OD值得出SOD、GSH-Px、MDA的水平。

1.3.7 海马组织GSK3β、Nrf2、HO-1蛋白水平测定:大鼠按400 mg/kg剂量腹腔注射水合氯醛后断头取脑,取海马组织,加入裂解液于冰上裂解30 min。将裂解液移至离心管,4 ℃下以12000 r/min离心5 min提取总蛋白。BCA法测定蛋白浓度,将蛋白样品上样至SDS-PAGE胶加样孔内,电泳、转膜后加入5% BSA于摇床上室温封闭2 h,加入稀释好的一抗(1∶1000)4 ℃过夜。一抗回收后TBST洗涤5～10 min,吸尽洗涤液后立即加入稀释好的二抗(1∶5000),室温孵育1 h,TBST洗涤5～10 min。ECL显影,凝胶成像系统曝光后用Image J软件分别计算GSK3β、Nrf2、HO-1与GAPDH的灰度值比值,得出蛋白相对表达量。

1.3.8 海马组织GSK3β、Nrf2、HO-1 mRNA水平测定:大鼠按400 mg/kg剂量腹腔注射水合氯醛后断头取脑。采用TRIzol法提取RNA:取海马组织100 mg,加入TRIzol试剂1 ml,匀浆器研磨后裂解 10 min,提取总RNA。采用反转录试剂盒将总RNA反转录,再按PCR试剂盒进行扩增,具体参数:95 ℃变性5 s,60 ℃退火34 s,扩增40个循环。结果采用2-ΔΔCt法分析,以GAPDH为内参。引物序列见表1。

表1 各基因引物序列

2 结 果

2.1 五组大鼠神经功能评分及脑含水量比较 见表2。假手术组未见肢体神经功能损伤。模型组神经功能评分及脑组织含水量较假手术组明显升高(均P<0.05)。与模型组比较,肉苁蓉苯乙醇苷低、高剂量组大鼠经治疗后神经功能缺损情况显著改善,神经行为学评分、脑组织含水量较模型组明显降低(均P<0.05)。

表2 五组大鼠神经功能评分及脑组织含水量比较

2.2 五组大鼠脑梗死占比比较 见图1。假手术组脑组织未见梗死灶,模型组、阳性对照组及肉苁蓉苯乙醇苷低、高剂量组脑组织出现不同程度苍白色损伤灶。模型组脑梗死占比较假手术组明显增多(P<0.05)。与模型组比较,肉苁蓉苯乙醇苷低、高剂量组脑梗死占比明显缩小(均P<0.05)。

注：A为假手术组,B为模型组,C为阳性对照组,D为肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组,E为肉苁蓉苯乙醇苷高剂量组。与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

2.3 五组大鼠海马组织神经元形态变化 见图2。假手术组海马神经元形态结构正常,细胞核清晰,尼氏小体丰富,呈蓝色,细胞核周围排列整齐。模型组细胞损伤明显,肿胀变性,结构紊乱,尼氏小体数量减少。与模型组比较,肉苁蓉苯乙醇苷低、高剂量组给药治疗后神经细胞形态改善,尼氏小体数量增多,细胞排列逐渐恢复规律。

注:A为假手术组,B为模型组,C为阳性对照组,D为肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组,E为肉苁蓉苯乙醇苷高剂量组

注：A为假手术组,B为模型组,C为阳性对照组,D为肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组,E为肉苁蓉苯乙醇苷高剂量。与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

2.4 五组大鼠血清SOD、GSH-Px、MDA水平比较 见表3。模型组与假手术组比较,血清SOD、GSH-Px活性明显降低,MDA含量显著增高(均P<0.05)。与模型组比较,肉苁蓉苯乙醇苷低、高剂量组血清SOD、GSH-Px活性升高,MDA含量下降(均P<0.05)。

表3 五组大鼠血清SOD、GSH-Px、MDA水平比较

2.5 五组大鼠海马组织GSK3β、Nrf2、HO-1蛋白表达比较 见图 3。模型组与假手术组比较, GSK3β蛋白表达增多,Nrf2、HO-1蛋白表达减少(均P<0.05)。肉苁蓉苯乙醇苷低、高剂量组海马组织GSK3β蛋白表达较模型组下调,Nrf2、HO-1蛋白表达上调(均P<0.05)。

2.6 各组大鼠海马组织GSK3β、Nrf2、HO-1 mRNA表达比较 见表4。模型组与假手术组比较,海马组织GSK3β mRNA表达明显增多,Nrf2、HO-1 mRNA表达显著减少(均P<0.05)。肉苁蓉苯乙醇苷低、高剂量组海马组织GSK3β mRNA表达较模型组显著减少,Nrf2、HO-1 mRNA表达则明显增多(均P<0.05)。

表4 各组大鼠海马组织GSK3β、Nrf2、HO-1 mRNA表达比较

3 讨 论

缺血性脑卒中病理过程较为复杂,发病机制涉及免疫炎症、自由基损伤、兴奋性氨基酸毒性等多个环节[10]。大脑是对缺氧最为敏感的器官,缺血、缺氧状态可对脑功能造成极大损害。以往研究[11]表明,氧化应激所产生的活性氧在脑缺血后神经细胞损伤中发挥关键作用。因此,有效激活机体内源性抗氧化系统,抑制氧化应激反应是防治脑缺血损伤的一个重要策略。

Nrf2是调节机体多种抗氧化物质和保护性酶类表达的核心转录因子[12]。在机体正常状况下,其与细胞质接头蛋白(Keap-1)结合于细胞浆而保持非活性状态,机体的氧化应激反应可促使Nrf2与Keap-1解偶连,Nrf2转入胞核内与ARE特异性结合,并促进其下游HO-1等抗氧化蛋白的表达[13]。早期研究[14]认为,Nrf2表达水平主要受Keap-1的调控。而近年研究[15]证实,Nrf2水平可受到GSK3β等不依赖于Keap-1的调控方式调节。GSK3β具有多种生物学功能,在脑缺血模型中应用GSK3β抑制剂处理可达到保护神经细胞功能、减轻缺血缺氧损伤的目的[16]。刘远玲[17]在MCAO脑缺血模型中抑制GSK3β活性后,总Nrf2和核内Nrf2的表达量均明显增加,同时升高了其下游抗氧化物HO-1和醌氧化还原酶1的表达水平,减轻了MCAO氧化应激损伤,证实了GSK3β在脑缺血中对Nrf2活性的负性调控作用。

肉苁蓉苯乙醇苷是从肉苁蓉中提取分离的一类苯乙醇苷类化合物。现代药理研究[18]表明,苯乙醇苷类化合物普遍具有抗氧化活性和神经保护功能,可用于氧化应激所致神经退行性疾病的防治。李刚等[19]研究发现,肉苁蓉苯乙醇苷干预可减轻大鼠精子膜脂质过氧化损伤,保护其结构和功能。骆新等[20]报道,肉苁蓉苯乙醇苷可有效改善低氧引起的大鼠脑组织水肿,减轻组织氧化损伤,提示肉苁蓉苯乙醇苷对脑组织损伤的修复作用可能与其抗氧化能力相关。本实验采用SD大鼠制备MCAO模型,给予肉苁蓉苯乙醇苷连续灌胃治疗14 d,考察肉苁蓉苯乙醇苷对脑缺血的神经保护作用。结果表明,肉苁蓉苯乙醇苷灌胃14 d后能够有效恢复MCAO大鼠神经功能,降低脑组织含水量,减轻脑组织梗死后海马神经元的损伤,提示肉苁蓉苯乙醇苷对MCAO大鼠具有明显良好的神经保护作用。

SOD和GSH-Px水平可反映机体清除自由基能力[21]。MDA含量可反映脂质过氧化程度[22]。通过ELISA检测大鼠血清SOD、GSH-Px和MDA的水平可见,模型组血清SOD、GSH-Px水平较假手术组显著降低,MDA含量明显升高,肉苁蓉苯乙醇苷灌胃治疗后明显升高了SOD、GSH-Px水平,降低了MDA含量,提示MCAO大鼠存在自由基过剩现象,而应用肉苁蓉苯乙醇苷可改善MCAO造成的自由基过剩和脂质过氧化。进一步探究其对GSK3β/Nrf2/ARE通路的作用发现,模型组海马组织GSK3β蛋白和mRNA表达量较假手术组明显增多,Nrf2、HO-1蛋白和mRNA表达明显减少,肉苁蓉苯乙醇苷干预后明显下调了海马组织GSK3β表达水平,同时上调了Nrf2、HO-1表达。通过以上结果可初步得出,肉苁蓉苯乙醇苷对MCAO大鼠的抗氧化损伤作用可能与调节GSK3β/Nrf2/ARE信号通路相关蛋白的表达相关。

综上所述,肉苁蓉苯乙醇苷可有效保护MCAO大鼠脑组织损伤,提高神经功能及抗氧化能力,其机制可能与调节GSK3β/Nrf2/ARE信号通路活化、激活抗氧化系统相关。