枸杞叶多糖调节T 细胞和巨噬细胞缓解过敏性哮喘小鼠气道炎症

白 敏， 吴建文， 张 颖， 张文静， 王 琦， 赵嘉庆，2，3

（1.宁夏医科大学基础医学院，银川 750004； 2.宁夏回族自治区医学科学研究所，银川 750004； 3. 宁夏医科大学医学科学技术研究中心，银川 750004； 4.宁夏医科大学临床医学院，银川 750004）

过敏性哮喘是一种由IgE 介导的过敏性疾病，Th1/Th2 免疫失衡是导致过敏性哮喘发生发展的重要因素[1]。哮喘患者会伴随咳嗽、喘息、呼吸困难和胸闷等症状[2-3]。气道炎症主要是由遗传易感个体在环境中过敏原暴露引起的[4]。蒿属花粉（Artemisia pollen）变应原是我国常见的花粉变应原之一，在我国各地区都有分布，约11.3% 的呼吸道过敏患者对蒿属花粉敏感[5]。其飘散期一般发生在春秋两季，秋季最为严重[6]。在我国分布最广的蒿属花粉有三种：黄花蒿花粉（Artemisia annuapollen）、艾蒿花粉（Aretemisia Argyi levl.etvant）、大籽蒿花粉（Artemisia sieversianawilld）[7]。目前国内外对于蒿属花粉引起的过敏性哮喘研究较少，有待探究其致病机制并研究出具有针对性疗效的药物。

枸杞叶是茄科枸杞属植物枸杞（lycium ChineseMill）及宁夏枸杞的干燥嫩叶[8]。枸杞叶多糖（lycium barbarum leaves polysaccharide，LBP）是枸杞叶中的一个主要药用成分[9]，表现出广泛的生物活性，如抗氧化剂[10]、神经保护[11]、辐射防护[12]、肝保护[13]、抗骨质疏松[14]和免疫调节活性[15]。本实验旨在探究LBP 对黄花蒿花粉引起的过敏性哮喘的影响，通过检测炎性细胞浸润水平，以及小鼠体内Th1、Th2 细胞、巨噬细胞占比的变化，为LBP 功效及治疗过敏性哮喘新药物的开发提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用6～8 周龄的雌性BABL/c 小鼠40 只［合格证号：SCXK（京）2016-0006；伦理审查批准号：2019-121］，体质量为18～25 g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司。适应性喂养1 周后，按照随机抽样的原则分为对照组、LBP 组、模型组、模型+LBP 组，每组10 只。对照组：正常小鼠灌胃等体积磷酸盐缓冲液（phosphate buffered aline，PBS）；LBP 组：正常小鼠灌胃等体积LBP；模型组：黄花蒿花粉引起的过敏性哮喘模型小鼠，灌服等体积PBS；模型+LBP 组：黄花蒿花粉引起的过敏性哮喘模型小鼠，灌服等体积LBP。实验动物均符合动物伦理委员会的要求，饲养在温度20～26 ℃，相对湿度45%～75% 的无特定病原体的动物房内。

1.2 材料与试剂

1.2.1 材料 本项目使用的LBP 从枸杞叶植物中提取，含量为60%，由宁夏森淼科技集团股份有限公司提供；黄花蒿抗原提取液，浓度为0.712 mg·mL-1，购自北京新华联协和药业有限责任公司。

1.2.2 试剂 氢氧化铝凝胶，浓度为40 mg·mL-1，购自美国Thermo Fisher 公司；Ⅰ型胶原酶、RPMI 1640 培养基、红细胞裂解液均购自北京索莱宝科技有限公司；细胞因子刺激剂，小鼠荧光抗体FITC 标记的CD4、CD11c、MHC class Ⅱ（I-A/IE），APC 标 记 的CD3、CD170（SiglecF）、CD206，PE 标记的白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）、F4/80，PerCP-Cy5.5 标记的γ 干扰素（IFN-γ），PE-Cy7 标记的CD11b，破膜液均购自美国BioLegend 公司。PE-Cy5.5 标记的CD45 购自美国Invitrogen 公司。苏木精-伊红染色（hematoxylineosin staining，HE）试剂盒、过碘酸-雪夫染色（periodic acid-schiff stain，PAS）试剂盒、马松染色试剂盒、磷酸盐缓冲液均购自武汉赛维尔生物科技有限公司；胎牛血清购自上海诺娃医药科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 构造黄花蒿花粉引起的过敏性哮喘小鼠模型 在过敏性哮喘模型构建前1 个月先给小鼠每天灌胃LBP 0.3 mL［100 mg·（kg·d）-1］直至造模结束小鼠被处以安乐死，对照组和模型组小鼠则以PBS 代替LBP。模型组、LBP 组在第31、38、45 天腹腔注射100 μL 的黄花蒿抗原（2 μg 黄花蒿过敏原蛋白与1 mg 氢氧化铝溶剂）进行致敏，第52～58 天每天进行滴鼻激发，黄花蒿花粉抗原提取液调整为0.2 mg·mL-1双侧滴鼻，每侧滴鼻10 μL；对照组、LBP 组采取同样的方法和剂量用PBS 进行致敏和滴鼻。第58 天滴鼻结束后由黄花蒿花粉引起的过敏性哮喘模型结束造模（图1）。第59 天安乐处死小鼠，留取样本。

图1 黄花蒿花粉引起的过敏性哮喘小鼠造模方案

1.3.2 小鼠肺组织处理 处死小鼠后，打开小鼠胸腔，分离肺脏，右肺放入10 倍体积的4%多聚甲醛组织固定液中制作石蜡切片，随后进行HE染色、PAS 染色、马松染色，染色后观察肺组织结构，炎性细胞浸润水平，杯状细胞黏液分泌情况及肺纤维化程度。左肺放入5 mL EP 管中，加入1 mL 提前配制好的Ⅰ型胶原酶，浓度为1 mg·mL-1，剪碎肺组织，放入气浴恒温振荡器消化1 h，加入10 μL EDTA 终止消化。将消化后的肺组织倒入两层300 目尼龙网膜中间。用300 目尼龙网膜过滤研磨，将细胞悬液收集到15 mL 离心管内，4 ℃、350×g、离心5 min，弃上清，留沉淀。向沉淀中加入红细胞裂解液，混匀重悬，为保持细胞活性，放在冰上裂解5 min。用适量的完全培养基重悬细胞沉淀，调整细胞浓度至1×107个/mL。制备好的肺细胞悬液准备进行流式细胞术染色。

1.3.3 流式细胞术染色方法 1）嗜酸性粒细胞（eosinophil granulocyte，EOS）染色：取100 μL 肺细胞悬液，加入表面抗体CD45、CD11c、CD170 混匀，冰上避光孵育30 min，经预冷的染色缓冲液洗涤后，加入300 μL 固定液重悬细胞，用流式细胞仪上机检测并分析EOS 细胞（CD45+CD11c-CD170+）。2）巨噬细胞染色：取100 μL 肺细胞悬液，先加入表面流式抗体F4/80、CD11b、MHC Ⅱ，冰上避光孵育30 min 后，加入1 mL 破膜液，离心弃上清，再加入100 μL 破膜液。随后加入胞内抗体CD206，室温孵育30 min，经预冷的染色缓冲液洗涤后，300 μL 固定液重悬细胞，用流式细胞仪上机检测并分析M1 细胞（F4/80+CD11b+MHCⅡ+）、M2（F4/80+CD11b+CD206+）细胞占比。3）Th细胞染色：取300 μL 处理好的肺细胞悬液转移到48 孔板中，加入胞内因子刺激剂离子霉素和佛波酯（PMA）37 ℃、5%CO2培养5 h。取100 μL 细胞悬液加入表面抗体，冰上避光孵育30 min，染色缓冲液洗涤后用100 μL 破膜液重悬，加入胞内抗体，边破膜边染色，室温孵育30 min，经预冷的染色缓冲液洗涤后，300 μL 固定液重悬细胞并用流式细胞仪分析Th1 细胞（CD3+CD4+IFN-γ+）、Th2 细胞（CD3+CD4+IL-4+）百分比。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，不服从正态分布的资料采用秩和检验进行分析。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠肺部病理学改变

2.1.1 肺组织HE 染色 肺组织HE 染色结果显示，与对照组小鼠比较，LBP 组无明显变化，模型组小鼠肺组织支气管管腔狭窄，肺泡腔及支气管内有大量的淋巴细胞及EOS 细胞浸润；但模型+LBP 组干预的小鼠肺组织炎症明显减轻，支气管周围炎性细胞数量明显减少，见图2。

图2 肺组织HE 染色（bar=200 μm）

2.1.2 肺组织PAS 染色 PAS 染色结果表明，与对照组小鼠比较，LBP 组小鼠肺组织无明显变化，模型组小鼠肺终末细支气管壁有大量紫红色颗粒，支气管腔内可见黏液分泌增多。而模型+LBP 组干预的小鼠支气管内虽有杯状细胞化生，但程度明显减轻，见图3。

图3 肺组织PAS 染色（bar=100 μm，↑：糖原颗粒）

2.1.3 肺组织马松染色 马松染色结果表明，LBP 组小鼠肺组织无明显变化，模型组小鼠相对于对照组小鼠，支气管周围蓝染区域明显增多，肺组织纤维化明显，气道上皮下胶原沉积明显增加，可见较厚的致密层，而模型+LBP 组干预的小鼠肺组织纤维化程度明显改善，见图4。

图4 肺组织马松染色（bar=100 μm）

2.2 流式细胞术检测小鼠肺部的EOS 细胞占比

模型组小鼠肺部EOS 细胞占比高于对照组（P＜0.01），而模型+LBP 组小鼠肺组织中EOS 细胞数量低于模型组（P＜0.01）。结合肺部病理学改变可知，模型组小鼠肺部炎性细胞浸润程度显著高于对照组小鼠，表明过敏性哮喘模型构造成功，见图5。

图5 肺组织EOS 细胞占比

2.3 流式细胞术检测小鼠肺组织中Th 细胞的变化

通过流式细胞术检测肺组织的单细胞悬液，结果显示，模型组小鼠肺组织Th1 细胞占比较对照组降低，Th2 细胞占比升高（P均＜0.05）。而模型+LBP 组小鼠Th1 细胞占比较模型组升高，Th2 细胞占比降低（P均＜0.01），见图6、图7。

图6 流式细胞术检测小鼠肺组织中Th1 细胞占比

图7 流式细胞术检测小鼠肺组织中Th2 细胞占比

2.4 流式细胞术检测小鼠肺组织中巨噬细胞极化

模型组小鼠较对照组相比，M1 型细胞数量减少，M2 型细胞数量增多（P均＜0.05）。模型+LBP 组小鼠与模型组相比M1 型和M2 型细胞均得到了纠正（P均＜0.05），见图8、图9。

图8 流式细胞术检测小鼠肺组织中M1 型细胞占比

图9 流式细胞术检测小鼠肺组织中M2 型细胞占比

3 讨论

近年来，过敏性疾病发病率的不断上升不仅降低了患者的生活质量，还给患者及其家庭乃至社会带来沉重的经济负担。不同过敏原存在抗原交叉反应。有研究报道，蒿属花粉与鼠尾草[16]、豚草花粉[17]、枣花粉[18]等均存在抗原交叉反应。同时，食物过敏和呼吸道过敏这两种常见过敏性疾病的患病率均上升[19]。许多植物源性食物，如榛子[20]、芥末[21]与花粉过敏原中的同源蛋白存在交叉反应[22]，导致由IgE 介导的花粉食物过敏综合征。因此，LBP 对多种过敏性疾病具有广泛的缓解作用，可能对与蒿属花粉存在交叉反应的过敏性疾病同样具有缓解作用。本研究以黄花蒿花粉为过敏原，证明LBP 对黄花蒿花粉引起的过敏性哮喘有缓解作用。

以往研究[23]表明，Th1 和Th2 细胞比例失衡是哮喘发展的关键因素。哮喘患者的气道活检和支气管肺泡灌洗液中存在大量活化的Th2 细胞，Th2 细胞分泌IL-4、IL-5 等细胞因子，Th2 细胞的相对增多抑制Th1 细胞分泌炎性抑制分子IFN-γ[24]。本研究中蒿属花粉引起的过敏性哮喘模型组，同样出现Th2 细胞显著增多、Th1/Th2 细胞失衡的现象，而服用LBP 后模型小鼠肺部Th2细胞减少，Th1 细胞增加，Th1/Th2 失衡有所缓解。巨噬细胞是一种与众不同的免疫细胞，能够同时表现出促炎和抗炎的功能[25]。暴露于局部微环境后，巨噬细胞功能的两个表现为经典激活（M1）和交替激活（M2）表型[26]。这两种巨噬细胞状态影响了T 细胞Th1、Th2 的平衡，巨噬细胞极化已被证明影响气道炎症发病机制，来自M2 巨噬细胞的细胞因子和趋化因子可能促进Th2 细胞分化、募集和EOS 细胞浸润[27]。本研究结果表明，黄花蒿花粉引起的过敏性哮喘小鼠肺部M1细胞减少、M2 细胞增多，而灌胃LBP 的小鼠可以改变巨噬细胞的极化，使小鼠肺部M1 细胞增多、M2 细胞减少。

Iwasaki 等[28]构建了巨噬细胞-Th2 细胞体外共培养模型和抗原特异性Th2 细胞转移小鼠模型，揭示M2 巨噬细胞与气道炎症的严重程度呈正相关，M2 与Th2 细胞在体内通过组胺信号传导协同诱导过敏性炎症。研究[29]表明，LBP 对巨噬细胞的增殖、极化功能有影响。LBP 具有抗炎作用[30]，可以通过改变糖酵解和巨噬细胞向M1分化来抑制炎症[31]。本研究中，灌胃LBP 小鼠体内M1 巨噬细胞增多，Th2 细胞减少，因此认为LBP 缓解过敏性哮喘可能是由于LBP 促进巨噬细胞向M1 分化，同时巨噬细胞与T 细胞通过信号传导协同，以减轻气道损伤程度，与上述研究相吻合，但具体机制还有待进一步研究。

综上所述，本研究中LBP 对由黄花蒿花粉引起的过敏性哮喘小鼠起到一定的预防缓解作用，减轻了黄花蒿过敏性哮喘小鼠肺部炎性细胞浸润，使得Th1、M1 细胞占比减少，表明LBP 可以在一定程度上纠正过敏性哮喘引起的体内Th1/Th2 和M1/M2 的失衡。LBP 能为黄花蒿花粉引起的过敏性哮喘提供新的治疗方向，为与蒿属花粉存在同源蛋白的食物或花粉引起的过敏性疾病的治疗提供新的治疗途径和理论基础。