外源脯氨酸对大叶樟幼苗碱胁迫的缓解效应研究

张丽华 韩浩章 李素华 赵 荣 王 芳 王晓立

（宿迁学院建筑工程学院，江苏 宿迁 223800）

大叶樟(Cinnamomum septentrionale)又称银木，为樟科（Lauraceae）、樟属（Cinnamomum）常绿乔木，主产于我国南方地区，是我国重要的造林绿化树种和经济树种，生长迅速，树形美观，适应性强[1]。前人的研究主要集中于引种栽培[2]、繁殖技术[3]、光合生理[4]和遗传多样性[5]等方面，金晶等[6]、李晓储等[2]、赵昌恒等[4]的研究认为，大叶樟比香樟（C. camphora）有更强的抗低温和耐盐碱能力，可在华东地区进行产业化生产和推广应用。王梦军等[7]于2018 年将大叶樟作为绿化树种引种到西安地区进行栽培，认为大叶樟在-10 ℃条件下可以正常生长，大叶樟在我国北方地区引种栽培成为可能，而我国北方部分地区城区绿地土壤的pH 值为8.4～9.0，碱化程度高于南方地区，营养元素缺乏，有机质含量普遍较低[8]，影响大叶樟的生产栽培，经常会出现叶片黄化现象。相对于盐胁迫，碱胁迫对植物的伤害程度更高，往往会导致植物光合能力明显下降，植物抗氧化酶系统明显受损，植物体内矿质元素的平衡被打破，根系生长受抑制，养分吸收困难[9]。植物对碱胁迫响应机制亦十分复杂，通常包括渗透调节、抗氧化系统、呼吸系统、代谢途径改变、细胞膜稳定性等方面，最近有报道氨基酸和有机酸等次生代谢物质参与植物适应逆境胁迫[10-11]。相同碱处理下，耐碱性强的芸豆（Peppermint extract）品种根系分泌物中含有更多的总氨基酸和有机酸[12]，脯氨酸和甜菜碱含量在高浓度碱胁迫下的增幅大于盐胁迫[13]。前期研究表明，碱胁迫下猴樟（C. bodinieri）体内的脯氨酸明显高于普通香樟，脯氨酸与樟属植物耐碱胁迫过程有关[14]。对榉树（Zelkova schneideriana）[15]、银杏（Ginkgo biloba）[16]、白花泡桐（Paulownia fortunei）[17]的研究结果也表明，碱胁迫条件下植物体内的脯氨酸含量会显著提高，抗性强的树种中含有更高的脯氨酸。外源施用脯氨酸能够促进植物光合能力和水分利用能力[18-19]，还能通过诱导华北紫丁香（Syringa oblata）抗氧化酶活性提高抗逆境胁迫能力[20]。目前关于外源脯氨酸对樟属植物耐碱胁迫的缓解作用及其调控机理研究较少，基于此，本研究以大叶樟幼苗为材料，初步研究外源脯氨酸离子对大叶樟幼苗碱胁迫的缓解效应，以期为大叶樟耐碱胁迫机理研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为樟属植物资源圃1 年生盆栽大叶樟幼苗，共90 盆，每盆3 株，共分6 个处理，每处理15 盆，苗高 (25 ± 2) cm。于2019 年10 月2 日选择生长健康的大叶樟母树采种，经低温沙藏处理后，2020 年2 月6 日播种，120 d 后移栽于盆中，栽培基质为基地田园土，土壤pH 7.51，土壤电导率810 μs/cm，土壤有机质含量12.55 g/kg。盆栽苗在玻璃温室中进行培养，正常管理。

1.2 处理方法

在前期研究基础上[9]，选择150 mmol/L 的Na2CO3溶液作为碱胁迫处理浓度（超过150 mmol/L 的Na2CO3溶液处理时，种苗表现生长不良现象），于2021 年3 月12 日 上 午9：00，按800 mL/盆标准进行浇灌处理，当日下午3：00 外源喷施浓度分别为0（CK）、50、100、150、200 mmol/L的脯氨酸溶液200 mL，至叶面滴水为止，剩余溶液浇施于盆内土壤中，之后正常管理。培养14 d后，各处理的土壤pH分别为8.51、8.62、8.47、8.40、8.65，同时检测大叶樟幼苗叶片叶绿素含量、叶绿素荧光参数、相对电导率、丙二醛（MDA）含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、苹果酸含量、过氧化物酶（POD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性和总抗氧化能力，3 次重复，取平均值进行统计分析。

1.3 试验方法

1.3.1 叶片叶绿素含量及其荧光参数测定

叶绿素含量测定采用乙醇法[21]；叶绿素荧光参数采用Yaxin-1161G 叶绿素荧光仪（北京雅欣理仪科技有限公司，北京）选择种苗中部成熟叶片进行测定，整株植物暗适应30 min 后，测定初始荧光（Fo）和最大荧光（Fm）；光适应下测定最大荧光（Fm'），稳态荧光（Fs）稳定后，打开远红光测定光适应下的最小荧光（Fo'）；参照尹勇刚等[22]的方法，分别计算PSⅡ最大光化学效率（Fv/Fm）、光化学猝灭系数（qP）和非光化学猝灭系数（qN）。

1.3.2 叶片渗透调节物质含量及抗氧化能力测定

叶片可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法[21]；可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法[21]；脯氨酸含量测定采用磺基水杨酸法[21]；有机酸含量采用酸碱滴定法，其中苹果酸的换算系数为0.067[21]；相对电导率采用抽气法[21]，MDA 含量测定采用硫代巴比妥酸（TBA）法[21]，POD 活性采用愈创木酚法，以每分钟减少0.01 个OD 值为1 个活力单位[21]；SOD 活性采用氮蓝四唑（NBT）法，以NBT 光化还原抑制率为50%时所用的酶量为1 个活力单位[21]；CAT 活性采用高锰酸钾滴定法，以每克鲜质量样品1 min 内分解H2O2的毫克数为酶活力[21]；PAL 活性采用紫外分光光度法，以每小时在290 nm 处OD 值增加0.01 所需酶量为1 个活力单位[21]；总抗氧化能力采用FRAP 法，以达到同样吸光度值所需的FeSO4标准溶液的毫摩尔数定义为FRAP 值[21]。

1.4 数据统计

将 所 测 定 的 数 据 输 入Microsoft Excel 2010，采用SPSS 22.0 进行数据统计，不同处理间的显著差异分析采用最小显著差数法（LSD）。采用隶属函数法对外源脯氨酸缓解大叶樟幼苗碱胁迫的效果进行综合评价，计算各处理的抗碱综合评价值（Dj），Dj表示j处理的抗碱性综合评价值[14]。其中与大叶樟盆栽幼苗耐碱性成正相关的叶绿素含量、Fo、Fm、Fv/Fm、qN、qP、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、苹果酸含量、SOD活性、POD 活性、CAT 活性和总抗氧化能力采用公式（1）计算隶属函数值（U）；对与盆栽幼苗抗碱性成负相关的MDA 含量、相对电导率和PAL 活性采用公式（2）计算隶属函数值（U）。

式中：i表示某个指标，j表示某个处理，Uij表示i指标j处理的抗碱性综合评价隶属函数值，Xij表示i指标j处理的实际测定值，Xjmin表示该指标所有测定值中的最小值，Xjmax表示该指标所有测定值中的最大值。

2 结果与分析

2.1 外源脯氨酸处理对碱胁迫下大叶樟幼苗叶绿素含量及其荧光参数的影响

由表1 可知，外源脯氨酸处理明显提高碱胁迫下大叶樟幼苗的叶绿素含量。随脯氨酸处理浓度的提高，大叶樟幼苗的叶绿素含量呈先上升后下降趋势，在100 mmol/L 的脯氨酸处理条件下，叶绿素含量达最高点，高于CK 26.53%，200 mmol/L脯氨酸处理时，叶绿素含量与CK 差异不显著；外源脯氨酸处理明显提高碱胁迫下大叶樟幼苗的Fo、Fm、Fv/Fm、qN、qP。随脯氨酸处理浓度的提高，大叶樟幼苗的Fo、Fm、Fv/Fm、qN、qP呈先上升后下降趋势，在100 mmol/L 的脯氨酸处理条件下，qN、qP达最高点，分别高于CK 1 057.14%和60%，在150 mmol/L 的脯氨酸处理条件下，Fo、Fm、Fv/Fm达最高点，分别高于CK 103.65%、184.21%和77.78%，200 mmol/L 脯氨酸处理时，qP与CK 差异不显著，Fo、Fm、qN显著高于CK（P＜0.05），而Fv/Fm显著低于CK（P＜0.05）。

表 1 脯氨酸和Na2CO3混合处理条件下大叶樟幼苗的叶绿素含量及其荧光参数Table 1 Chlorophyll content and fluorescence parameters of C. septentrionaleseedlings treated with proline and Na2CO3

2.2 外源脯氨酸处理对碱胁迫下大叶樟幼苗渗透调节能力的影响

由表2 可知，外源脯氨酸处理明显提高碱胁迫条件下大叶樟幼苗的渗透调节能力。随脯氨酸处理浓度的提高，大叶樟幼苗的MDA 含量和相对电导率基本呈下降趋势，在超过150 mmol/L 脯氨酸处理后达最低值，分别低于CK 30.52%和33.70%，200 mmol/L 脯氨酸处理时仍明显低于CK（P＜0.05）；外源脯氨酸处理下大叶樟幼苗的可溶性蛋白含量、脯氨酸含量和苹果酸含量均呈先上升后下降的趋势，可溶性糖含量呈逐步上升趋势；150 mmol/L 的脯氨酸处理时大叶樟幼苗的可溶性蛋白含量和脯氨酸含量达最高值，分别高于CK 7.17%和49.85%，在100 mmol/L 的脯氨酸处理时苹果酸含量达最高值，高于CK 187.88%；200 mmol/L 脯氨酸处理时可溶性糖含量达最高值，高于CK 16.16%，而此时叶片中的脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、苹果酸含量与CK 差异不显著。

表 2 脯氨酸和Na2CO3混合处理条件下大叶樟幼苗的渗透调节能力Table 2 Osmotic regulation ability of C.septentrionaleseedlings treated with proline and Na2CO3

2.3 外源脯氨酸处理对碱胁迫下大叶樟幼苗抗氧化能力的影响

由表3 可知，外源脯氨酸处理明显提高大叶樟幼苗在碱胁迫下的抗氧化能力。随脯氨酸处理浓度的提高，大叶樟幼苗SOD、POD、CAT 活力和总抗氧化能力呈先上升后下降趋势，其中POD、CAT 活力的最高值出现在100 mmol/L 的脯氨酸处理时，分别高于CK 64.49%和228.76%，SOD 活力和总抗氧化能力的最高值出现在150 mmol/L 的脯氨酸处理时，分别高于CK 59.66%和84.10%；PAL 活力呈先下降后上升趋势，在150 mmol/L 的脯氨酸处理时达最低点，显著低于CK 22.08%；200 mmol/L 的脯氨酸处理时，SOD 和POD 活力显著高于CK（P＜0.05），而总抗氧化能力、CAT 和PAL 活力与CK 差异不显著。

表 3 脯氨酸和Na2CO3混合处理条件下大叶樟幼苗的抗氧化能力Table 3 Antioxidant capacity of C.septentrionaleseedlings treated with proline and Na2CO3

2.4 外源脯氨酸处理缓解大叶樟幼苗碱胁迫综合能力评价

综合评价值（D）能量化反映植物对碱胁迫环境的综合抵抗能力，D值在0 ~ 1 之间，D值越大则表示植物抗碱胁迫能力越强。由图1 可知，随着外源脯氨酸处理浓度的增加，大叶樟盆栽幼苗的耐碱胁迫能力综合评价值呈先上升后下降的趋势，在150 mmol/L 脯氨酸处理条件下达最大值0.917，在200 mmol/L 脯氨酸处理时D值迅速下降至0.386，但仍高于CK，外源脯氨酸处理明显提高了大叶樟的耐碱胁迫能力。

图 1 外源脯氨酸处理后大叶樟幼苗耐碱胁迫能力综合评价值Fig. 1 Comprehensive evaluation value of alkali stress tolerance ofC.septentrionaleseedlings treated with exogenous proline

3 结论与讨论

植物适应逆境胁迫的机制非常复杂，氨基酸和有机酸等次生代谢物质的含量增加是植物适应逆境胁迫过程的主要措施之一，除了渗透调节外，能促进细胞内离子平衡，稳定膜的结构与功能[10-11]，外源施用脯氨酸能诱导盐胁迫下脯氨酸合成相关酶P5CS 基因表达量下降和脯氨酸脱氢酶PDH 基因表达量的提高，促进植物对脯氨酸的利用能力[23-24]，保障植物茎和根系的正常生长[25]。在本研究中，适宜浓度（100 ~ 150 mmol/L）的外源脯氨酸处理明显提高碱胁迫下大叶樟幼苗的叶绿素含量、Fo、Fm、Fv/Fm、qN、qP，降低电导率和MDA 含量，提高可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、苹果酸含量和脯氨酸含量，明显提高SOD、POD、CAT 活性和总抗氧化能力，降低PAL 活性，提高了植物抗碱胁迫能力，与Wani 等[26]关于油菜（Brassica napus）、Hossain 等[27]关于绿豆（Vigna radiata）、Zheng 等[28]关于凹叶柃木（Eurya emarginata）的研究结果一致；逆境胁迫下，游离脯氨酸除了参与渗透调节外，还能稳定膜和蛋白质结构，清除活性氧，参与细胞信号转导和基因表达[20]。叶绿素是植物主要的光合色素，以蛋白复合体的形式存在于叶绿体内的类囊体膜上，通过吸收和传递光能参与光合作用中的能量分配，其含量变化与植物光合功能相关[29]。逆境胁迫会导致植物的叶绿体结构被破坏，光系统功能受损，叶绿素降解，活性氧含量增加[30]。Fo是光系统Ⅱ（PSⅡ）反应中心处于关闭时的初始荧光产量[31]，光系统功能受损与叶绿素含量增加均会导致Fo升高[22]。外源脯氨酸处理提高大叶樟内源脯氨酸含量，提高对叶绿体结构和叶绿素复合结构的稳定性，提高叶绿素含量，从而一定程度提高了Fo，与尹勇刚等[22]对葡萄（Vitisvinifera）的研究结果一致。叶绿素荧光参数中，人们通常用Fm反映通过PSⅡ的电子传递情况，用Fv/Fm值体现PSⅡ反应中心内原初光能的转换效率（最大转换效率），用光化学反应猝灭系数（qP）反映光化学活性的高低。逆境胁迫下，植物叶片Fm、Fv/Fm、qP值通常会下降[30-31]，而外源脯氨酸处理能提高Fm、Fv/Fm、qP，提高了碱胁迫下大叶樟的光能利用能力。非光化学淬灭系数（qN）通常代表PSⅡ吸收的光能中以热的形式耗散掉的部分，反映了光能耗散为热的能力[31]，不同植物qN在逆境条件下的变化规律不尽相同，金星宇等[31]、包颖等[32]的研究认为qN随盐浓度提高和胁迫时间的延长而提高，光合结构受损，而贺立红等[33]对银杏（Ginkgo biloba）、王舒甜等[34]对香樟的研究结论认为，逆境胁迫下植物通过非光化学淬灭提高热耗散来消耗更多的激发能以适应胁迫环境[34-35]。通常樟属植物的光合速率较低，而qN和叶绿素含量较高的芳樟无性系在提高光能利用能力的同时，能将剩余的光能以热的形式耗散，从而保护其光合机构[29]，与本研究结果一致，外源脯氨酸处理使大叶樟幼苗的qN远高于对照，明显提高植物抗碱胁迫环境的能力。可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸等渗透调节和抗氧化酶系统是植物适应逆境胁迫的重要措施[14-16]，适宜浓度外源脯氨酸可能作为信号激活了可溶性糖、可溶性蛋白、苹果酸等物质的代谢途径和SOD、POD 等抗氧化酶基因的表达[20]，提高植物在碱胁迫下的渗透调节能力和活性氧清除能力，其中苹果酸含量在100 mmol/L 脯氨酸处理时显著高于对照187.88%，说明以苹果酸为代表的有机酸参与了外源脯氨酸对大叶樟碱胁迫的缓解作用，参与方式可能与呼吸代谢和缓解根际周围的高pH 环境有关，与郭立泉等[10]关于星星草（Puccinellia tenuiflora）、柯梅等[36]关于冰草（Agropyron cristatum）、麻莹等[11]关于盐地碱蓬（Suaeda liaotungensis）的研究结果一致；PAL 活性随脯氨酸处理浓度提高呈先下降后上升趋势，在150 mmol/L 的脯氨酸处理时达最低点，PAL 活性与大叶樟耐碱性呈负相关，植物体内的PAL 是苯丙烷类生物合成途径的关键酶，主要参与黄酮类和酚类物质代谢，与植物抗氧化能力相关[37-38]，PAL活性与大叶樟耐碱性的关系尚需进一步研究。外源脯氨酸处理具有浓度效应，低浓度（50 mmol/L）脯氨酸处理对大叶樟耐碱胁迫的缓解效果不显著，100 ~ 150 mmol/L 的外源脯氨酸处理明显提高大叶樟耐碱胁迫能力，高浓度（200 mmol/L）脯氨酸处理后，大叶樟幼苗相对电导率、MDA 含量和Fv/Fm明显降低，Fo、Fm、qN、SOD 活性、POD活性和可溶性糖含量提高，而叶绿素含量、qP、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、苹果酸含量、CAT活性、总抗氧化能力、PAL 活性与对照差异不显著，对大叶樟耐碱胁迫的缓解效果不明显。隶属函数法综合评价值D的结果也表明，随着脯氨酸处理浓度的增加，D值在150 mmol/L 脯氨酸处理条件下达最大值0.917，在200 mmol/L 脯氨酸处理时明显下降，高浓度脯氨酸处理提高大叶樟耐碱胁迫的效果不理想的原因可能是部分施入土壤中的高浓度脯氨酸对大叶樟幼苗产生了渗透胁迫，影响了植物根系的生长和功能。

综上所述，适宜浓度的外源脯氨酸处理提高碱胁迫下大叶樟幼苗的叶绿素含量、荧光参数、渗透调节能力和抗氧化能力，对大叶樟幼苗碱胁迫有明显缓解作用，而高浓度的外源脯氨酸处理效果较差，有机酸参与外源脯氨酸缓解大叶樟碱胁迫的过程。结合隶属函数法综合评价值结果，150 mmol/L 的外源脯氨酸处理效果最好。