外源物质对低温胁迫条件下高粱种子萌发的影响

韩云，安娇艳，王海莲，王润丰，张燕，赵影星，刘宾，张华文，夏徽

(1. 新疆生产建设兵团第四师农业科学研究所，新疆可克达拉 835219；2. 中国农业大学，北京 100091；3. 山东省农业科学院作物研究所/山东省特色作物工程实验室，山东济南 250100)

低温冷害是影响冷敏感作物生长发育、地域分布、产量和品质的主要逆境因子，是世界性自然灾害，也是我国北方主要气象灾害之一[1，2]。 高粱起源于非洲，是喜温作物，对温度的变化表现敏感。 高粱萌发的最低土温为8～10℃，出苗的最低温度为10～12℃，但萌发温度较低时会减缓高粱生长，尤其是萌发期和幼苗期低温影响严重。Upadhyaya 等[3]研究发现，12℃显著影响高粱种子的萌发能力。 我国北方春季高粱播种后，经常遭遇低温天气(倒春寒)，致使高粱发芽、出苗困难，严重时发生烂种(粉种)[4-6]，造成缺苗断垄。种子萌发和幼苗阶段低温冷害已经成为影响高粱产量的重要因素之一[7]。 此外，持续低温胁迫还会使高粱幼苗更易感染丝黑穗病。 因此，研究外源物质对低温胁迫下高粱种子萌发的影响，对高粱生产具有重要意义。

利用外源物质引发种子技术，已广泛应用于农业生产中。 外源物质引发下种子发芽率均不同程度提高。 因此，采取种子引发技术，促进低温环境中的作物种子萌发，对北方春播作物种子萌发、幼苗健康生长及产量形成十分重要。 除梁佳等[8]利用隶属函数法综合评价干旱胁迫下外源物质的引发效应外，大多数研究仅停留在单一外源物质的引发效应上，鲜有比较多种外源物质引发高粱种子耐低温效应的综合评价报道。 为此，本试验以粒用高粱品种济粱3 号为材料，研究低温胁迫条件下外源物质芸苔素内酯(epibrassinolide，EBR)、水杨酸(salicylic acid，SA)、赤霉素(gibberellin，GA3)、褪黑素(melatonin，MT)、硫酸锰(MnSO4)和硅酸钾(K2SiO3)对高粱种子萌发及幼苗生长的影响，以期筛选出最佳的外源物质及其浓度，同时为这6 种外源物质促进高粱抗低温胁迫的生理机制提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用干净饱满、大小一致、种子发芽率85%以上的济粱3 号高粱种子。

赤霉素(纯度≥96%)、褪黑素、硅酸钾和芸苔素内脂均购自上海麦克林生化科技有限公司。水杨酸(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司。 硫酸锰(分析纯)，购自天津市恒兴化学试剂制造有限公司。

1.2 试验设计与方法

试验于2022 年4—7 月在山东省农业科学院作物研究所实验室进行。 MnSO4、MT 和SA 等6种外源物质均设计5 个浓度梯度，详见表1。

表1 6 种外源物质的5 个浓度梯度

挑选干净饱满的济粱3 号种子，用5%次氯酸钠消毒10 min，去离子水洗净。 分别挑选25 份大小均匀一致种子各10 g，将其分别倒入25 个直径9 cm 的培养皿中，分别添加不同浓度的硫酸锰、褪黑素等6 种物质溶液1 mL，充分摇动2 min，使溶液均匀地粘在种子表面，然后黑暗闷种2 h。 在铺有双层滤纸的培养皿(直径9 cm)中加蒸馏水5 mL，然后将处理好的种子均匀摆放其上。 每处理分别选择30 粒种子，重复3 次。 第1 天将培养皿置于黑暗条件下培养，10℃下10 h，20℃下14 h。从第2 天开始将培养皿置于夜/昼温度10℃/20℃(低温胁迫)、光周期10 h 光/14 h 暗、白天光照12000 lx、相对湿度60%的人工气候箱内培养。常温对照培养条件:光周期12 h/12 h、白天光照12000 lx、温度25℃和相对湿度60%。 每天观测培养皿中种子萌发生长情况并及时加蒸馏水。

1.3 指标测定及方法

1.3.1 发芽势、发芽率和发芽指数 胚根长至种子长度且胚芽长大于等于种子长度的一半作为高粱种子的发芽标准。 从第3 天开始统计发芽种子数并计算种子发芽势，第8 天计算发芽率。

发芽势(%)＝第3 天发芽种子数/供试种子数×100 ；

发芽率(%)＝第8 天发芽种子数/供试种子数×100 。

萌发指数(PI)＝(1.00nd2+0.75nd4+0.50nd6+0.25nd8)/N。 式中，nd2、nd4、nd6、nd8分别为第2、4、6、8 天萌发种子数，N 为种子总数。

1.3.2 生物学指标 第8 天，各处理每个培养皿随机取10 株幼苗，用吸水纸擦干表面水分，切分出胚根与胚芽，用万分之一天平称取胚芽和胚根鲜重，并测量根长和芽长。

试验数据采用标准化处理即相对值(处理指标值/对照指标值)进行统计分析，以消除环境因子影响，并利用相对值评价6 种外源物质对高粱种子萌发及幼苗生长的抗低温效应。

相对发芽率(RGR)、相对发芽势(RGP)和相对发芽指数(RGI)采用梁佳[8]、Amooaghaie[9]和Li[10]等的方法计算。

1.4 抗低温胁迫效应综合评价

利用隶属函数法建立综合评价体系，分析高粱种子在萌发期及幼苗期抗低温胁迫的能力。 有关隶属函数及权重等的计算方法[4，8]如下:

式中，Yij为第i 个评价指标第j 个处理的隶属值；Uij为i 个评价指标第j 个处理的测定值，Umax为该指标中的最大值，Umin为该指标中的最小值；为第i 个评价指标的均值，n 为处理个数；Vi为第i个评价指标的标准差系数；Wi为第i 个评价指标的权重系数，m 是评价指标的个数；Dj为第j 个处理的综合评价得分值。

1.5 数据处理与分析

数据采用Microsoft Excel 2010 整理并绘图，采用SPSS 19 软件进行方差分析。 利用聚类分析就低温胁迫条件下外源物质对高粱种子引发的效应进行分类。

2 结果与分析

2.1 不同浓度外源物质对低温胁迫下高粱种子萌发的影响

图1 ～图3 表明，低温胁迫下，6 种外源物质间、不同浓度间及其交互作用均极显著影响高粱种子的相对发芽势、相对发芽率和相对发芽指数(Sig.值小于0.01)。 高粱种子经同一外源物质处理后，随其浓度增加，种子相对发芽势、相对发芽率和相对发芽指数均表现出先升后降趋势。 其中EBR处理的种子发芽势、发芽率和发芽指数均优于其它处理，浓度为0.030 μmol·L-1时其相对发芽率、相对发芽势和相对发芽指数均达到最高值。这6 种外源物质浓度过大或者过小均影响高粱种子的发芽率、发芽势和发芽指数，因此，适宜浓度可有效引发高粱种子的萌发及生长。

图1 不同浓度外源物质对低温胁迫下高粱相对发芽率的影响

图2 不同浓度外源物质对低温胁迫下高粱相对发芽势的影响

图3 不同浓度外源物质对低温胁迫下高粱相对发芽指数的影响

2.2 不同外源物质对低温胁迫下高粱幼苗生长的影响

图4 ～图9 表明，不同外源物质间、不同浓度间及其交互作用均极显著影响低温胁迫下高粱幼苗生长(Sig.值小于0.01)。随着外源物质浓度增加，这6 种物质引发的幼苗各项生长指标均先增后降。图4、图6 中，GA3引发幼苗的相对芽长、相对芽鲜重均高于其它处理，MT 处理次之，其中6.0 μmol·L-1GA3(G3)处理的相对芽长、相对芽鲜重值均最大。然而GA3处理的相对根长、相对根鲜重、相对根干重均比其它外源物质处理总体偏低。 用0.5 mmol·L-1MT(M5)处理种子，其幼苗相对根鲜重、相对根干重值均达到最大(图7和图9)，其次是1.0 mmol·L-1SA(S3)处理。 50 mmol·L-1硅酸钾引发的种子其幼苗相对根长最长(图5)。

图4 不同浓度外源物质对低温胁迫下高粱幼苗相对芽长的影响

图5 不同浓度外源物质对低温胁迫下高粱幼苗相对根长的影响

图6 不同浓度外源物质对低温胁迫下高粱幼苗相对芽鲜重影响

图7 不同浓度外源物质对低温胁迫下高粱幼苗相对根鲜重的影响

图8 不同浓度外源物质对低温胁迫下高粱幼苗相对芽干重的影响

图9 不同浓度外源物质对低温胁迫下高粱幼芽相对根干重的影响

2.3 不同外源物质引发下高粱种子萌发期的抗低温效应分析

表2 中D 值代表外源物质不同浓度下高粱种子萌发期抗低温的综合效应，D 值越大其抗低温胁迫的效应就越强[11]。 由表2 可知，本试验中相对发芽势的权重系数最大，达到0.3365，其次是相对根鲜重和相对芽长的权重系数，三者之和达65.4%。浓度为0.5 mmol·L-1MT 处理的综合得分最高，为0.7244。 各处理综合得分高低顺序如下:M3＞E3＞S3＞M4＞M2＞E4＞G3＞E2＞Mn2＞G4＞G2＞K3＞M1＞Mn3＞K2＞S4＞K4＞S2＞G1＞E1＞0＞Mn4＞K1＞Mn1＞S1。

2.4 不同浓度外源物质缓解高粱低温胁迫效应的聚类分析

根据综合得分D 值进行聚类分析，当欧氏距离为5 时，25 个不同浓度外源物质引发处理可分为3 类(图10)。 其中，第1 类D 值在0.4268 ～0.7244之间，为排名前8 的处理，有M3、E3、S3、M4、M2、E4、G3 和E2；0.2616≤D≤0.3695 为第2类，有Mn2、G4、G2、K3、M1、Mn3、K2 共7 个处理；0.1097≤D≤0.2358 为第3 类，有S4、K4、S2、G1、E1、0、Mn4、K1、Mn1、S1 共10 个处理。

图10 25 个引发处理聚类分析谱图

3 讨论

3.1 外源物质对低温胁迫条件下高粱种子萌发及幼苗生长的影响

低温胁迫对高粱种子萌发及幼苗生长影响的指标主要有发芽势、发芽率、发芽指数、幼苗芽长、根长及干物质重等。 其中，发芽势是反映种子萌发整齐度和萌发速度的主要指标，发芽指数则可反映种子活力。 有研究表明低温胁迫对种子萌发及幼苗生长有较明显的抑制作用[12，13]。 本研究表明，适宜浓度的EBR 处理能显著增强低温胁迫后的种子发芽势，这与黄斌[14]、周伟江[15]等的结论相同。 说明适宜浓度的EBR 处理可以加快低温胁迫下的高粱种子出苗速度，提高出苗率，可为保全苗、稳增产奠定基础，又可预防或减轻低温对高粱种子和幼苗生长的危害。 GA3处理的种子其相对芽长、相对芽鲜重优于其它外源物质处理，但高粱幼苗生长管理的目标是培育壮苗，而不是高脚苗，因此GA3的浓度必须严格控制，以防造成高粱幼苗徒长。 0.50 mmol·L-1MT 处理幼苗相对根鲜重及相对根干重均最大，其它物质中1.0 mmol·L-1SA 处理的最高。 可见，不同外源物质在低温胁迫下其作用机制不一样，因此可以进一步研究利用不同性质的外源物质组配种子处理剂以抗低温胁迫。

3.2 评价高粱种子萌发期抗低温效应的方法

本试验结果表明，高粱种子经不同浓度供试外源物质处理后，其萌发及幼苗生长指标值差异较大。 为了防止用单个指标评价某种外源物质抗低温胁迫能力的片面性[8]，本试验采用隶属函数法的综合得分值量化不同外源物质及其浓度配比引发种子对低温胁迫的效应，这种综合评价方法可避免因单参数评价引起的误差。

3.3 外源物质引发对高粱种子萌发期及幼苗抗低温效应的影响

本研究中，高粱种子相对发芽势、相对芽长和相对根鲜重的权重系数之和达65.4%，说明这3个指标在本试验评价体系中占主导地位。 利用综合得分D 值进行聚类分析结果显示，本试验25个处理可以分为3 类，其中第1 类处理的综合分值为0.4268～0.7244，得分最高的3 个处理依次是M3(0.50 mmol·L-1MT)、E3(0.030 μmol·L-1EBR)和S3(1.0 mmol·L-1SA)，这3 个处理均能有效促进种子萌发和幼苗生长，该结果与梁佳等[8]的研究结果类似，而第3 类处理的综合分值为0.1097 ～0.2358，对提高种子萌发期的抗低温胁迫效果不大。 本试验表明，EBR 处理种子发芽势、发芽指数均优于其它外源物质处理，经GA3引发的种子其芽长及芽鲜重均优于其它外源物质处理，而MT 处理在促进根系和幼芽方面均有促进作用。一定浓度范围内SA、MnSO4和K2SiO3均可促进高粱根系生长。 根据北方高粱春播区农业生产实际情况，本试验推荐的外源物质处理为E3(0.030 μmol·L-1EBR)、M3(0.50 mmol·L-1MT)和S3(1.0 mmol·L-1SA)。

4 结论

本研究结果表明，适宜浓度的外源物质引发高粱种子可增强其萌发期及幼苗期的抗低温胁迫能力，各处理综合得分高低顺序如下:M3 ＞E3 ＞S3＞M4＞M2＞E4＞G3＞E2＞Mn2＞G4＞G2＞K3＞M1＞Mn3＞K2＞S4＞K4＞S2＞G1＞E1＞0＞Mn4＞K1＞Mn1＞S1。 利用隶属函数法建立的综合评价体系，可量化并较为全面地评价低温胁迫下供试外源物质不同浓度引发种子萌发、生长的抗低温胁迫效应。本试验中，0.030 μmol·L-1EBR 处理高粱种子的相对发芽势和相对发芽指数最大，0.50 mmol·L-1MT、1.0 mmol·L-1SA 处理均能有效促进种子萌发和幼苗生长，以0.50 mmol·L-1MT 处理引发种子后的效果最佳。