甘薯CLE 多肽家族的全基因组鉴定和IbCLE12 的克隆及抗旱性表达分析

周媛媛，赵春玲，侯夫云，李爱贤，秦桢，王庆美，董顺旭

(1. 山东省农业科学院作物研究所，山东济南 250100；2. 山东师范大学，山东济南 250014)

多肽类激素与脱落酸、茉莉酸、细胞分裂素、生长素、赤霉素、乙烯等传统植物激素一起，在植物抵御逆境胁迫过程中起重要作用，近年来多肽激素的研究进展较快[1，2]。 CLAVATA3/Embryo surrounding region-related (CLE)多肽家族是研究最多的一类多肽激素[3，4]，其命名依据是拟南芥CLAVATA3(CLV3)和玉米胚胎周边区(embryo surrounding region， ERS)；在结构上，一般编码50～200 个氨基酸的小蛋白，N-末端存在一个分泌信号肽，C-末端存在一个含14 个氨基酸的保守结构域，中间是可变区域[5]；根据CLE motif 的首个氨基酸类型将其分为R(arginine，Arg)和H(histidine， His)两类，这两类之外的统称other类[6]。 相关研究表明，CLE 家族成员在根、茎尖分生组织的干细胞分裂和分化、维管(原)形成层、激素信号响应以及抗逆性响应中发挥着关键性作用[7-9]。 目前，在拟南芥中发现32 个CLE 成员[6]，其中，CLE25 多肽在根部响应干旱胁迫，并通过BAM 受体将缺水信号传导至叶片，与ABA共同调控气孔的关闭，减少蒸腾作用，从而提高对干旱的抗性[9]。

甘薯[Ipomoea batatas(L.) Lam.]是世界主要农作物之一，可用作粮食、饲料、工业原料和新型能源，广泛种植于100 多个国家或地区，具有重要的经济价值[10，11]。 甘薯在生长过程中经常遭受干旱等逆境胁迫[12]，所以研究CLE 家族成员及其功能对提高甘薯抗逆性具有重要意义。 目前已有57 个植物基因组中的1628 个CLE 多肽得到预测，但在甘薯中尚未见研究报道。 本研究利用野生型甘薯Ipomoea trifida(H.B.K.) G. Don.的基因组[13]，系统挖掘甘薯CLE 家族成员，利用生物信息学方法进行分析，并进一步从甘薯栽培种中克隆得到IbCLE12基因，利用实时荧光定量法分析其在干旱胁迫下的表达，以期为探究甘薯CLE 多肽家族基因的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

甘薯近缘二倍体野生种Ipomoea trifida(H.B.K.) G. Don.，是栽培甘薯的祖先种之一，其基因组测序已经完成。 甘薯栽培种选用济薯25。

1.2 Ipomoea trifida CLE 家族基因的全基因组鉴定及分析

1.2.1 甘薯CLE 家族基因的筛选 基于甘薯组学资源网GT4SP 项目的基因注释文件(http:/ /sweetpotato.plantbiology.msu.edu/index.shtml)查找所有已注释的ItfCLE基因，并下载相关序列。

1.2.2ItfCLE基因结构分析 利用ProtParam 在线软件(https:/ /web.expasy.org/protparam)分析ItfCLE 蛋白理化性质。 利用TMHMM 2.0(https:/ /services.healthtech.dtu.dk/service.php? TMHMM-2.0)分析基因的跨膜螺旋位点，利用Soft-Berry ProtComp 9.0 预测蛋白亚细胞定位情况。利用MEME (http:/ /meme-suite.org/tools/meme)分析ItfCLE 氨基酸序列的保守结构域，参数设置为允许保守结构域重复出现、搜索得到的保守域上限为6 个、基序长度为10 ～100。 利用TBtools工具绘制ItfCLE基因结构图。

1.2.3 ItfCLE 家族的系统发育分析 采用MEGA 5.0 软件的NJ 法，基于保守CLE motif 氨基酸序列，构建ItfCLEs 和拟南芥AtCLEs 的系统发育进化树，Bootstrap 重复1000 次。

1.2.4ItfCLEs基因的组织特异性表达和不同逆境下的表达谱分析 利用甘薯基因组学资源网站中的RNA-seq 基因表达数据，用FPKM(fragments per kilobase per million mapped reads)值表示基因相对表达水平，利用TBtools 建立热图，进行不同基因间聚类。

1.3 IbCLE12 基因的克隆及表达分析

1.3.1IbCLE12基因的克隆 利用TRIzol 试剂盒(Invitrogen，上海，中国)提取总RNA，利用TaKa-Ra 反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)对样品进行反转录，获得济薯25 的cDNA，利用TaKaRaLA Taq试剂盒扩增IbCLE12基因的完整CDS 序列。 扩增引物为IbCLE12-F(5＇-ATGGGTAGTAATTTGAGGAGTAGGA-3＇)和IbCLE12-R(5＇-TCATGGCTTGTCAAGCTCTCC-3＇)。 扩增体系(50 μL):LA Taq0.5 μL，LA Buffer(Mg2+plus)8 μL，dNTP Mixture 5 μL，引物混合物2 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 32.5 μL。 扩增程序:94℃3 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，34 个循环；72℃10 min。

1.3.2 干旱胁迫和ABA 处理下IbCLE12基因的表达分析 用2021 年收获的济薯25 薯块，在温室中培养4 周，取长势一致、含5～6 个功能叶的茎段，分别用含20% PEG6000 和100 mmol/L ABA 的1/2 霍格兰溶液处理，分别于处理0、3、6、12、24、48 h取叶片，用液氮速冻，-80℃保存备用。

利用Invitrogen TRIzol 试剂盒提取总RNA，利用TaKaRa反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 对每个样品进行反转录，利用SYBR PremixEx TaqⅡ定量试剂(Tli RNaseH Plus， TaKaRa， 大连， 中国) 在Roche LightCycler®480Ⅱ(Roche，英国)进行qRT-PCR分析。 扩增引物为ItfCLE-qPCR-F(5＇-TATTGGTGGGAGTGGTTGGGT-3＇)和ItfCLE-qPCR-R(5＇-CATGCTCATATGCCTCATGCT-3＇)。 扩增体系:SYBR Green Master Mix 5 μL，引物混合物0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.6 μL。 反应程序:95℃预变性2 min；95℃变性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸15 s，40 个循环。

使用内参基因IbActin为校准，利用2-ΔΔCt计算基因的相对表达水平。 每个样品进行3 次重复试验，以未处理(0 h) 的样品为对照，采用Student’st-test 方法进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 ItfCLE 基因的筛选和蛋白特征分析

从I.trifida中筛选到12 个CLE 家族基因，根据其在染色体上的位置进行重新编号，分别命名为ItfCLE1～ItfCLE12(表1)。 这12 个ItfCLE 蛋白长度在81 ～154 个氨基酸之间，分子量在9.0 ～17.5 kDa 之间，等电点均大于7，属于碱性蛋白。只有ItfCLE2 和ItfCLE6 为稳定蛋白，其余均为不稳定蛋白，且ItfCLE3 不稳定系数最高。 除分子量最大的ItfCLE5 为疏水脂溶蛋白外，其余均为亲水性脂溶蛋白。 根据保守区的首个氨基酸类型分类，只有ItfCLE6 属于H 型，其余均为R 型。

表1 ItfCLEs 蛋白理化性质

利用MEME 软件分析ItfCLE 蛋白的保守结构域，共获得6 个保守基序，分别命名为Motif1 ～Motif6。 12 个 ItfCLE 成员均含有 Motif1(VSKRKVPSGPBPJHN)，所以，Motif1 是甘薯CLE的特征保守基序(图1)。

图1 ItfCLE 蛋白保守基序分析

根据蛋白定位预测结果(表2)，12 个ItfCLE蛋白在胞外都有分布；仅ItfCLE9 在质膜中有分布，其余蛋白则在细胞质、过氧化物酶体以及叶绿体中有分布。 据此推测ItfCLE 蛋白可能主要存在于过氧化物酶体、叶绿体以及细胞质中，外排到胞外。

表2 ItfCLE 蛋白的定位分析

2.2 ItfCLEs 的进化分析

通过ItfCLEs 与AtCLEs 的进化关系树(图2)可知，甘薯的ItfCLEs 主要分为5 个亚族。 Itf-CLE1、 ItfCLE4、 ItfCLE6、 ItfCLE8、 ItfCLE11、 Itf-CLE12 亲缘关系较近，其中，ItfCLE1、ItfCLE8、Itf-CLE4 与拟南芥的AtCLE45 属于同一组，ItfCLE12与AtCLE25 属于同一组，ItfCLE6 与AtCLE46 属于同一组；ItfCLE10 与AtCLE27 亲缘关系较近；ItfCLE3 和ItfCLE2 属于同一亚族，并与AtCLE20 亲缘关系较近；ItfCLE7 与AtCLE9、AtCLE10 亲缘关系较近；ItfCLE5 和ItfCLE9 属于同一亚族，分别与AtCLE13 和AtCLE8 亲缘关系较近。

图2 甘薯12 个ItfCLEs 和拟南芥32 个AtCLEs 进化树分析

2.3 ItfCLE 基因的组织特异性表达分析

结果(图3)表明，ItfCLE9、ItfCLE10在花中有较高的表达；ItfCLE4、ItfCLE12在根中有较高的表达；ItfCLE1、ItfCLE3、ItfCLE5、ItfCLE7、ItfCLE11在各组织中表达量较低，差异较小；ItfCLE2、ItfCLE6和ItfCLE8在茎中表达较高。

图3 甘薯12 个ItfCLE 基因的组织特异性表达分析

2.4 ItfCLE 基因在不同逆境胁迫下的表达特征分析

结果(图4)表明，与对照相比，ItfCLE10受旱、盐胁迫和两种病害处理后下调表达；ItfCLE8受旱、盐胁迫后上调表达，受冷和热胁迫后下调表达；ItfCLE12受旱胁迫和病2 处理后上调表达，受盐、冷和病1 胁迫后下调表达；ItfCLE3受盐、冷、热胁迫后下调表达。 其余基因受胁迫后表达量变化较小。

图4 甘薯12 个ItfCLE 基因的表达谱分析

2.5 IbCLE12 基因的克隆和氨基酸序列比对

利用同源克隆方法在济薯25 中克隆得到Itf-CLE12的同源基因，命名为IbCLE12。 氨基酸序列比对结果(图5)表明，IbCLE12 与ItfCLE12 一致性较高，仅在第23、26 位有两个氨基酸的差异；IbCLE12与AtCLE25的一致性达到32.74%，两者C 端保守CLE 基序一致。

图5 IbCLE12 与ItfCLE12、AtCLE25 的序列比对

2.6 IbCLE12 基因受干旱和ABA 诱导表达分析

结果(图6)表明，IbCLE12基因受干旱和ABA 诱导上调表达，分别在处理6 h(5.48 倍)和12 h(5.06 倍)表达量最高。 处理时间延长，表达量显著降低。

图6 干旱(A)和ABA(B)胁迫下IbCLE12 基因的表达情况

3 讨论与结论

CLE 家族基因编码的多肽是21 世纪以来发现的新型多肽激素，在细胞间的信号交流中发挥重要作用[3，5，14]。 CLE 蛋白信号肽使蛋白迁移至细胞膜，并与膜上的受体激酶特异性结合，将信号转导至下游分生组织发育的WUSCHEL(WUS)转录因子，形成信号转导模块，从而调控分生组织的干细胞增殖和分化，最终影响根、茎等器官的分化[15]。 甘薯野生种I.trifida中包含12 个CLE 家族基因，蛋白C 端均包含CLE 保守结构域，家族基因数量少于拟南芥等模式植物，可能与数据库组装过程中小分子基因的覆盖度相关[16]。 甘薯作为块根作物，根中分生组织的干细胞分化和增殖直接影响形成层的发育，并最终与产量密切相关。 有研究表明，通过对人参CLE 家族序列特征和系统进化关系进行分析，发现PgCLE基因对其根型发育起重要的调控作用[17]。 本研究结果表明，ItfCLE在野生型甘薯中存在明显的组织表达差异性，其中，ItfCLE9、ItfCLE10在花中有较高的表达；ItfCLE4、ItfCLE12在根中有较高的表达；Itf-CLE2、ItfCLE6和ItfCLE8在茎中表达较高；Itf-CLE1、ItfCLE3、ItfCLE5、ItfCLE7、ItfCLE11在各组织中表达量较低，差异较小。 可见，甘薯中CLE成员在不同器官发育过程中可能发挥不同的调控作用。

CLE 家族基因在作物响应生物胁迫中也具有重要调节作用。 研究表明，在大豆囊线虫、马铃薯囊线虫和根结线虫中具有和宿主类似的CLE，并通过与宿主中的CLE 受体相互作用，提高线虫对宿主的侵染力[18，19]。 敲除CLE 受体可以显著提高大豆对大豆囊线虫的抵抗能力[20]。 本研究结果表明，与对照相比，在两种病害胁迫下大部分ItfCLEs表达量变化不大，但ItfCLE7、ItfCLE10明显下调表达，ItfCLE12在病1 处理下也表达下调，推测其在生物胁迫中主要起负调控作用。

CLE 家族基因在作物抵御非生物胁迫中也发挥重要作用。 研究表明，拟南芥的AtCLE25 多肽可以实现从根到芽的长距离信号转导，并通过介导ABA 信号途径促进气孔关闭，感应根的缺水信号，提高植物的抗旱性[9]；AtCLE45通过下游受体SKM1 和SKM2 调节拟南芥种子形成过程中的耐热性[21]。 在拟南芥缺失突变体cle40-2中，ABA合成通路上的AtCLE25、AtCLE45基因表达下调，说明其在ABA 合成通路上起关键的正调控功能[22]。 在本研究中，受旱胁迫后明显上调表达的有ItfCLE8和ItfCLE12，而ItfCLE12 与拟南芥At-CLE25 亲缘关系较近，推测ItfCLE12在甘薯抗旱性中发挥调控作用。 为此，我们在甘薯栽培品种中克隆了ItfCLE12的同源基因IbCLE12，并进行模拟干旱和ABA 处理，结果表明该基因分别在处理6 h 和12 h 受干旱和ABA 诱导显著上调表达，可为深入研究IbCLE12在甘薯抗旱性中的分子机制奠定基础。