十二卷属植物新品种‘山之翠’花梗发生培养试验初报

方连明 姜亮 汤桂钧 王赟 卜顺法 殷家栋 陆锦明

（1 上海市闵行区三农综合服务中心，上海 201109；2 上海市闵行区农业技术服务中心，上海 201199；3上海铭桂实业有限公司，上海 201101） *为通信作者

十二卷属花卉是近年来在我国快速发展流行的名贵观赏花卉，已逐渐走进寻常百姓家，成为了市民选购盆栽中的新宠[1]，极适宜在办公室、居室、厅堂、阳台等处作摆放装饰用，具有清新、优雅之美，同时可吸收空气中的有害气体，从而洁净空气，具有一定的环保功能。十二卷属多肉类植物有4 个大类，分别为“万象”“玉扇”“寿锦”“玉露”，品种繁多，且都有抽生花梗的习性，即在花梗顶端着生几十朵小花（小花是十二卷属多肉类植物特有的繁殖器官，但大多是花而不实，需人工授粉）。

十二卷属植物与很多木本植物及部分草本植物有抽生花梗的相似特性，且其花梗的每个节间中均隐藏有腋芽，故可通过刺激腋芽发育成幼芽，再通过侧芽(腋芽)分生组织发育成枝条(植株)[2]。‘山之翠’是百合科十二卷属“万象”系列中的名贵新品种，是国际上著名的“万象”四大品种之一，种苗价格十分昂贵。在此背景下，为获得价廉物美的‘山之翠’优质种苗，笔者在数年前独家引进‘山之翠’专利品种的种苗进行盆栽养护，并应用组织培养技术对其半木质化的花梗，进行了嫩茎段离体发生培养试验，以期刺激腋芽萌发并长成“丛生芽”，从而为育成试管苗夯实基础。笔者经过反复试验，‘山之翠’花梗离体发生培养终获成功。现将相关试验结果报道如下，以供相关人员参考借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验地点及品种来源

试验在上海铭桂实业有限公司（上海市松江区场西路398 号）的组织培养室内进行。新品种供试‘山之翠’是由上海铭桂实业有限公司自国外独家引种的专利品种苗。

1.2 材料处理

1.2.1 材料来源与取材时间

培养材料为盆栽2年后的‘山之翠’大苗。于2021年9月中旬，盆栽的‘山之翠’肉质叶片叶丛中抽出花梗，长度为35 cm 左右；9 月21 日，花梗顶部最下端约有1/4 的花朵已开花，整支花梗有弹性，呈“半木质化”状态，自基部将整支花梗剪下，并立即将其置于盛有清水的玻璃瓶中，以防花梗失水萎蔫。

1.2.2 外植体材料的清洗与消毒

取材当天，将花梗进行处理。先剪去基部2 cm左右、已老熟以及顶端幼嫩尚未达半木质化的部分，并剪去花蕾（朵），留长度为30～40 cm 的花梗，用洗洁精清洗3 遍，然后将花梗剪成长度为8 cm 左右的嫩茎段，用干净纱布包裹后置于自来水龙头下冲洗3 h，再将冲洗干净的嫩茎段置于超净工作台上进行消毒处理，即先用75%酒精消毒1 min、无菌水冲洗1 次，再用15%次氯酸钠消毒15 min、无菌水冲洗3 次，最后用无菌滤纸吸干水分备用。

1.2.3 嫩茎段切割与接种

在超净工作台上将已消毒的嫩茎段切成长为2 cm的茎段，每段带1～2个茎节，接种于发生培养基上，每瓶接种1个茎段。为比较观察嫩茎段发生培养与其他培养方法的优劣，以相同品种的肉质叶片和当年授粉获得的种子为对照，分别接种30瓶进行比较。其中，肉质叶片切成大小为1 cm2的方块，当年授粉获得的种子每瓶培养1粒，消毒方法同1.2.2。

1.3 花梗嫩茎段离体发生培养

为获得合适的‘山之翠’离体发生培养基配方，共配制了6 种配方：(1）MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L ；(2）MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L；(3）MS+BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L；(4）MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.20 mg/L；(5）M S+BA 2.5 m g/L+N AA 0.25 mg/L ；(6）MS+BA 3.0 mg/L+NAA 0.30 mg/L。各种培养基配方均加蔗糖30 g/L、琼脂粉5 g/L、活性炭2 g/L，调节pH 在5.8 左右。每种培养基配方配制30 瓶，每瓶灌装50 mL 左右的培养基，每瓶接种1 个茎段，不设重复。

1.4 光照与温度设置

设置培养室温度为25 ℃、24 h 恒温。为防止茎段离体消毒后产生褐化现象，接种后第1周内保持暗培养、不加光，第2周开始每天于7:00—20:00用LED 灯给予13 h 的光照，光照强度为3 500 lx 左右，培养架每层间距为40 cm。

1.5 调查统计

分别在培养约30 d、茎段腋芽开始露白萌动后，以及培养约60 d、腋芽明显伸长（有的长出愈伤组织）后，观察、调查、统计各培养基配方的茎段存活状况，目测是否发生褐化或有无萌芽。同时，根据萌芽瓶数，计算“丛生芽”实际发生率(以腋芽伸长3 mm 左右为准)，评价各材料、培养基配方的优劣，筛选出最佳配方。

2 结果与分析

2.1 不同外植体材料的离体发生培养结果比较

由表1可知，采用花梗嫩茎段进行离体发生培养具有显著优势，“丛生芽”发生率达到了93.3%。在花梗嫩茎段离体发生培养中，于暗培养、不加光培养1周后观察，大多数茎段仍保持绿色；在培养2周后，茎段节间腋芽开始萌动露白；在培养30 d 后，露白的节间上开始长出叶原基，并不断生长；在培养60 d 时，叶原基已长成长度在3 mm 以上的幼芽，并逐渐长成“丛生芽”，预示花梗嫩茎段发生培养法取得基本成功，这一结果与前人的有关研究结果相似[3-4]。在肉质叶片离体发生培养中，于培养30 d后，切口周边逐渐膨大，以后缓慢长出黄白色的愈伤组织，再经几周培养，愈伤组织不断分化成长为半透明的晶状体（表面凹凸不平），再培养6个月后，愈伤组织表面开始分化出芽点并不断生长，形成幼芽。在种子离体发生培养中，由于人工授粉结实种子的成熟度不一致，种子又十分细小，导致种子发芽不整齐，发芽率只有56.7%，且发芽后的种苗生长缓慢，生长势不强，培养半年以上才形成“丛生芽”。以上结果表明，花梗嫩茎段是‘山之翠’外植体离体发生培养的最佳选择，符合组织培养技术中“从芽到芽”的理论与实践要求，故利用花梗嫩茎段进行离体发生培养，对于加快繁育‘山之翠’这一名贵品种的优质种苗、保持品种优良性状等具有积极意义。

表1 不同外植体材料的离体发生培养结果比较

2.2 花梗嫩茎段不同发生培养基配方比较试验

由表2可知，在6种离体发生培养基配方中，以配方（4）的离体发生培养结果最好。具体表现为：据接种后1周观察，配方（4）的嫩茎段仍保持绿色，无褐化现象，培养2周后发现，绿色茎段上端与下端切口已膨大并呈黄白色，表明愈伤组织已长出，茎段已进入旺盛生长阶段；配方(3)与配方(4)的离体发生培养结果类似；配方(1)和配方(2)的离体发生培养结果一般；配方(5)和配方(6)的茎段上下端切口膨大现象较为突出，这可能与配方中的激素浓度较高有关。在培养近3 周时，配方（4）在茎段节间处的腋芽开始萌动露白，甚至有2 个节间的腋芽同时萌动的现象，在培养30 d 后，露白的节间上开始长出叶原基并不断生长，在培养60 d 时，叶原基已长成长度在3 mm 以上的幼芽，叶片开始展开，幼叶颜色由黄白色转为浅绿色，且随着幼叶的不断生长，其圆柱肉质形状的叶片中长出腋芽，起先有1～2 个，以后逐渐增多并由单个腋芽长成小植株，有的在其基部长出小芽（所有这些新芽组成“丛生芽”），这是‘山之翠’组织培养成功与否的起始步，也是关键一步；配方（1）、配方（2）的萌芽情况均不理想，茎段腋芽萌动十分缓慢，有的茎段在培养3 周后仍未萌芽，呈“休眠”状态，直至培养1个月后才稍有腋芽萌动露白，但数量较少；配方（3）的萌芽稍快；配方（5）、配方（6）的萌芽萌动露白与配方（4）差不多同时出现，但其萌动的芽点仅不断膨大，未长成幼芽，且完全变成了亮白色、半透明的愈伤组织（似“蜂窝”状，表面有小突起，突起呈浅绿色），约培养半年后，在降低激素浓度后又分化成幼芽，这可能与配方中激素浓度过高密切相关。有研究证实，在激素浓度较高时，有些茎段外植体需通过在愈伤组织阶段产生不定芽，这种繁殖途径的缺点是随着愈伤组织继代培养代数的增加，不定芽的形成能力逐渐下降，遗传不稳定性也随之增加[5]。

表2 花梗嫩茎段不同培养基配方的离体发生培养结果比较

3 结论与讨论

‘山之翠’是国际上十二卷属“万象”系列中的四大名贵品种之一，其生长缓慢，繁殖力低下，种苗奇缺，价格极其昂贵。以半木质化的花梗嫩茎段作为外植体进行离体发生培养，是快速获得优质种苗、保持品种优良特性及遗传稳定性的捷径，具有事半功倍的效果。试验结果证明，采用‘山之翠’的花梗嫩茎段进行离体发生培养具有显著优势，在培养2周后，嫩茎段节间腋芽开始萌动露白；在培养30 d后，露白的节间上开始长出叶原基，并不断生长；培养60 d 时，叶原基已长成长度在3 mm 以上的幼芽，并逐渐长成“丛生芽”， “丛生芽”发生率达到了93.3%，这为以后的继代增殖培养乃至育出优质试管苗奠定了基础。其中，培养基配方(4)（MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.20 mg/L）为最适宜进行‘山之翠’花梗嫩茎段离体发生培养的培养基配方，在接种1～2周后，其嫩茎段仍保持绿色，无褐化现象发生，且绿色茎段上端与下端切口已膨大长出愈伤组织，可以为茎段材料积累原始养分并供母体吸收；在培养60 d 时，叶原基已长成长度在3 mm 以上的幼芽，叶片开始展开，幼叶颜色由黄白色转为浅绿色，且随着幼叶不断生长，其圆柱肉质形状的叶片中长出腋芽，并由单个腋芽长成小植株，有的在其基部长出小芽，由此组成“丛生芽”。

活性炭是一种无机矿物质类吸附剂，对植物组织培养过程中的褐化现象有一定的抑制作用[6]。本试验在所有培养基配方中均添加了0.2%活性炭，这对抑制外植体材料的褐化起到了一定的作用。同时，笔者观察到，不添加活性炭时，经过消毒和切割后，‘山之翠’花梗嫩茎段出现了不同程度的褐化或腋芽萌动延迟的现象，这是因为在消毒过程中，‘山之翠’花梗嫩茎段被化学物质杀伤、氧化，而花梗嫩茎段因切割而使多酚类物质自切口外渗，从而发生了褐化、死亡。此外，笔者在实践中发现，经消毒和切割后的‘山之翠’花梗嫩茎段在接种后，若马上在加光状态下进行培养，亦会产生褐化或黄化现象，且即使在添加活性炭后仍有一定程度的褐化现象发生，其发生机理有待进一步研究；而将接种后的培养瓶放至培养室后，在第1周内进行暗培养、不加光，在第2 周后每天给予13 h 的光照，起到了保障嫩茎段正常生长的作用。因此，在发生培养基配方中添加0.2%活性炭及在接种后第1周内进行暗培养，是‘山之翠’半木质化花梗茎段发生培养技术中的辅助方法，可防止或减轻嫩茎段出现褐化或黄化现象，确保花梗嫩茎段的发生培养成功。