蒙药蓝刺头对去卵巢大鼠BGP、BMD及股骨组织形态的影响∗

赵 军，李 昕，刘 岩，王雄耀，师建平△，董重阳，常 虹

1 内蒙古自治区中医医院，内蒙古 呼和浩特 010020； 2 内蒙古医科大学附属医院，内蒙古 呼和浩特 010050； 3 内蒙古医科大学中医学院，内蒙古 呼和浩特 010110

蒙医学将人类体质分幼少年、青壮年、老年等阶段，老年处于体热趋于减弱、营养降低时期，骨脆性增加。五元中骨属土，赫依寓所，病变串行赫依之路，易发骨折等因糟粕、精华减弱功能。在蒙医学中，骨质疏松属赫依病范畴。绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMOP）因绝经后女性卵巢功能衰退所致。蒙药蓝刺头主治骨折筋伤、骨伤热、金创等［1］。本研究观察蒙药蓝刺头对去卵巢OP 模型大鼠血清骨钙素（bone gla protein，BGP）调节、股骨近干骺端骨密度（bone mineral density，BMD）、股骨近干骺端形态改变、骨髓脂肪改变，为蒙医“补暖补精-清镇赫依-固骨质壮骨”理论防治PMOP提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物Wistar雌性4月龄大鼠77只，购于内蒙古大学实验动物研究中心，实验动物合格证号：SCXK（蒙）2002-0001。内蒙古医科大学基础实验楼病理实验室，每笼11只，购回7天左右环境适应。

1.2 药品及试剂蓝刺头制剂由广州中医药大学提供；产地：新疆乌鲁木齐市天山区；采摘时间：2018年7月。强骨胶囊（北京岐黄制药有限公司，产品批号：188103，国药准字Z20030007，规格：0.25 g/粒）；己烯雌酚片（合肥久联制药有限公司，产品批号：20180925，国药准字H34021250，规格：0.5 mg/片）；骨钙素ELISA 试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司，批号：20180953）。

1.3 实验方法

1.3.1 分组及造模 将63 只大鼠随机平均分为7 组。复制PMOP 模型参考文献［2］，创口缝合5 日后，大鼠阴道脱落细胞涂片［3］表示造模成功；假手术组造模方法：沿大鼠下腹部切开以后，找到大鼠卵巢，在卵巢周边切除卵巢大小的脂肪。将造模成功的大鼠进行分组：蒙药蓝刺头高、中、低剂量组，己烯雌酚组、强骨胶囊组、模型组、假手术组，每组9只。见图1—2。

图1 动情间期光镜下雌鼠阴道涂片（×400）

图2 动情期光镜下雌鼠阴道涂片（×400）

1.3.2 药物干预 购回大鼠正常饲喂1 周后开始造模分组，90 天后给药，蒙药蓝刺头中、高、低剂量组依人鼠体质量比、人鼠代谢速率比折算分别以13.750 0、27.500 0、6.875 0 mg/mL 给予蒙药蓝刺头溶液，临床等效低剂量组为准，中、低、高剂量比例为2∶1∶4。强骨胶囊组给予浓度为23.437 5 mg/mL 的对应药物，己烯雌酚组给予浓度为0.031 3 mg/mL 的对应药物。模型组和假手术组给予相等毫升数的生理盐水。

1.3.3 标本采集 采集大鼠血液离心检测血清BGP；取双侧完整股骨，测左股骨BMD，右股骨用4%甲醛溶液固定HE染色。

1.4 观察指标

1.4.1 BMD 计量学测定 显微CT 下进行大鼠右股骨近干骺端BMD分析。

1.4.2 血清BGP 表达 采用酶联免疫法测大鼠血清BGP表达，步骤按BGP试剂盒说明书进行。

1.4.3 大鼠左侧股骨近端干骺端脱钙［4］取5张切片，每组大鼠（n0）随机选择5 个视野，每张切片（n1），光学显微镜下观察各组染色，股骨近干骺端组织形态、骨髓脂肪细胞密度、脂肪细胞直径计量。1.5 统计学方法 采用SPSS 13.0 统计软件行数据统计分析，计量资料以±s表示，方差齐性检验方差齐，多样本均数比用方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠股骨BMD 计量显微CT 扫描大鼠右侧股骨近干骺端BMD 计量示：模型组与假手术组比差异有统计学意义（P＜0.01）；蒙药蓝刺头中剂量组、假手术组、强骨胶囊组、己烯雌酚组与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；蒙药蓝刺头高、低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；蒙药蓝刺头中剂量组、强骨胶囊组、己烯雌酚组、假手术组与蒙药蓝刺头高剂量组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；蒙药蓝刺头中剂量组、强骨胶囊组、己烯雌酚组、假手术组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠BMD及BGP计量比较（±s）

表1 各组大鼠BMD及BGP计量比较（±s）

注：与模型组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；与假手术组比较，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

BGP （ng/mL）组别鼠数BMD（g/cm3）185.1435±0.9832△201.1726±0.2259*183.4583±0.8954△198.3716±0.1563*199.1478±0.1325*174.3627±0.3684△△210.7642±0.1425**蓝刺头高剂量组蓝刺头中剂量组蓝刺头低剂量组强骨胶囊组己烯雌酚组模型组假手术组9 9 9 9 9 9 9 0.247±0.267△0.311±0.038*0.243±0.352*0.296±0.536*0.394±0.018*0.187±0.043△△0.398±0.059**

2.2 大鼠血清BGP 水平大鼠血清BGP 水平比较：模型组较假手术组、蒙药蓝刺头中剂量组、己烯雌酚组、强骨胶囊组明显降低（P＜0.01）；蒙药蓝刺头高、低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；蒙药蓝刺头高剂量组与强骨胶囊组、己烯雌酚组、蒙药蓝刺头中、低剂量组、假手术组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；强骨胶囊组、己烯雌酚组、蒙药蓝刺头中剂量组、假手术组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.3 大鼠左侧股骨近干骺端形态学改变假手术组大鼠骨质疏松样改变不明显，骨小梁粗细均匀，结构完整，骨小梁之间连接较好，脂肪细胞、骨细胞形态清晰。模型组见骨松质结构改变，部分骨小梁明显纤细或出现断裂，连接不完整，骨质形态学破坏。蒙药蓝刺头中剂量组、强骨胶囊组、己烯雌酚组见骨松质骨小梁改变不明显，未现明显纤细、断裂，相互连接好，结构完整。蒙药蓝刺头高、低剂量组较模型组骨组织形态改善，差异不明显。见图3。

图3 大鼠左侧离体股骨近干骺端骨质形态学观察（HE，×400）

2.4 大鼠左侧离体股骨近干骺端骨髓脂肪细胞密度及脂肪细胞直径左侧股骨近干骺端HE 骨髓脂肪细胞密度、脂肪细胞直径，模型组与假手术组相比，明显增高（P＜0.05）；蒙药蓝刺头中、低剂量组及假手术组、强骨胶囊组、己烯雌酚组与模型组相比，明显降低（P＜0.05）；蒙药蓝刺头高剂量组与模型组相比，差别无统计学意义（P＞0.05）；蒙药蓝刺头中、低剂量组及强骨胶囊组、己烯雌酚组、假手术组与蒙药蓝刺头高剂量组相比，明显降低（P＜0.05）；蒙药蓝刺头中、低剂量组及强骨胶囊组、己烯雌酚组、假手术组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。蒙药蓝刺头高剂量组大鼠骨髓组织内可见有脂肪细胞增多，脂肪细胞体积较大，数量较多，密度有所增大。

蒙药蓝刺头中剂量组大鼠骨髓组织内可见有脂肪细胞偏少，脂肪细胞体积较小、数量较少。蒙药蓝刺头低剂量组大鼠骨髓组织内可见有脂肪细胞偏少，脂肪细胞分散，呈小圆球形。强骨胶囊组大鼠骨髓组织内可见脂肪细胞数量较少、密度小，脂肪细胞分散。己烯雌酚组大鼠骨髓组织内可见脂肪细胞密度小，脂肪细胞分散，呈小圆球形。模型组去除卵巢后大鼠骨髓组织内可见有脂肪细胞增多，脂肪细胞体积较大，骨髓脂肪细胞直径明显变大，数量较多，密度有所增大，一定数量的脂肪细胞聚集在一起，之间相互挤压，呈圆形或多边形。假手术组大鼠骨髓组织内可见有脂肪细胞偏少，脂肪细胞体积较小、数量较少、密度小，脂肪细胞分散，呈小圆球形。见表2、图4。

表2 各组大鼠左侧离体股骨近干骺端骨髓脂肪细胞密度、脂肪细胞直径比较（±s）

表2 各组大鼠左侧离体股骨近干骺端骨髓脂肪细胞密度、脂肪细胞直径比较（±s）

注：与模型组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；与假手术组比较，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

脂肪细胞密度（mm/mL）组别视野数（n0×n1）脂肪细胞直径（μm）253.786±39.451△184.452±29.369*203.376±30.452*189.478±31.235*178.856±29.325*278.426±36.528△△167.746±28.429**蓝刺头高剂量组蓝刺头中剂量组蓝刺头低剂量组强骨胶囊组己烯雌酚组模型组假手术组25 25 25 25 25 25 25 43.287±3.872△30.176±2.634*27.478±2.943*28.754±2.756*29.368±2.541*46.542±3.837△△31.253±2.671**

图4 各组大鼠光学显微镜下左侧离体股骨近干骺端骨髓脂肪细胞密度、脂肪细胞直径（HE，×400）

3 讨论

OP 以骨量单位体积降低，损坏骨微结构，骨矿物质、骨基质随年龄增加（或妇女绝经）等比例减少，骨微结构改变致骨荷载正常功能变化，骨脆性增加，易发骨折［5］。BGP又称骨γ-羧基谷氨酸蛋白，是一种由骨骼中成骨细胞产生的非特异性胶原蛋白［6］。其病理性增高常见于骨转换加快如高转换型骨质疏松。脂肪增多对骨髓和骨骼强度的影响机制如下：一是脂肪含量在骨髓中增多是对松质骨内骨小梁变薄、数量减少、小梁间隙增大的代偿填充［7-8］；二是骨髓填充骨小梁间隙对松质骨有机械支撑、缓冲能力作用［7］；三是OB和成脂细胞同祖［9］，二者同源骨髓脂肪间充质干细胞［10］。研究显示，绝经后女性雌激素水平降低，牙周膜干细胞分化成骨下降［11-14］，说明雌激素通过调控成骨、破骨平衡调节重塑骨，促进干细胞分化成骨，抑制分化成脂。研究显示：蒙药蓝刺头具有植物雌激素样作用，通过雌激素样作用促成骨，调节骨吸收与骨形成偶联，降低骨转换，达防治PMOP 的目的［15-17］。本实验结果表明，血清BGP、BMD、股骨、骨髓脂肪改变方面模型组与假手术组差别明显；适当剂量蒙药蓝刺头可有效降低血清BGP、提高BMD、改善股骨组织形态、抑制骨髓脂肪过快、过度表达。

综上所述，大鼠在去卵巢以后血清BGP、股骨近端干骺端骨髓脂肪细胞密度、脂肪细胞直径表达计量结果均明显增高，骨组织结构破坏严重，BMD 明显降低；蒙药蓝刺头使血清BGP 表达、骨髓脂肪细胞密度、脂肪细胞直径明显降低，效果同己烯雌酚、强骨胶囊相似，为蒙医“补暖补精-清镇赫依-固骨质壮骨”理论防治PMOP 提供实验依据，其详细机制、作用通路需进一步研究。