基于生物信息学分析TUBG1基因在肝细胞肝癌中的表达及其预后价值

侯沅林，刘洁兰，李钰颖，卢诗丽，胡婷，莫丽梅，唐玉莲，2

（1.右江民族医学院；2.右江民族医学院研究生院，广西 百色 533000）

肝细胞肝癌（Liver hepatocellular carcinoma，LIHC）是世界上最常见的致命恶性肿瘤，在我国LI⁃HC已成为恶性肿瘤的第二大病因，每年死于LIHC的人数位列全球第一，对人类健康威胁极大［1］。微管蛋白γ1（Tubulin gamma 1，TUBG1）基因为编码微管蛋白超家族的一个成员，该基因位于染色体17q21.2。TUBG1基因编码的蛋白质定位于中心体，在中心体上与微管结合，作为γ微管蛋白复合物的一部分。该蛋白介导微管成核，在微管细胞骨架的组织中起核心作用，是微管形成和细胞周期进展所必需的。目前，已有研究发现，TUBG1基因与非小细胞肺癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤、成神经管细胞瘤以及皮质发育畸形的发生发展关系密切［2-6］。TUBG1基因可促进微管聚合，诱导肿瘤细胞纺锤体形成，加速肿瘤细胞分裂进程，从而促进肿瘤发生和发展。因此，TUBG1基因在肿瘤发生发展中起重要作用，是肿瘤进展中的关键调节成分。目前，关于TUBG1基因在LIHC中的表达与预后尚未见研究报道。本研究通过多个数据库探讨TUBG1基因在LIHC中的表达及其预后价值，为干预治疗LIHC提供靶点。

1 材料与方法

1.1 分析TUBG1基因在不同肿瘤组织中的表达利用TIMER 2.0数据库分析TUBG1基因在不同肿瘤组织中的表达。选择TIMER 2.0数据库下的“Exploration”模块，点击“Gene-DE”，输入基因“TUBG1”，点击“Submit”，检索出TUBG1基因在不同肿瘤组织及其正常组织中的表达。

1.2 分析TUBG1基因在LIHC和正常对照组织中的差异表达 使用GEPIA数据库分析TUBG1基因在LIHC和正常对照组中的表达情况，并利用UALCAN数据库进行差异表达验证。GEPIA数据库选择“Cancer Type Analysis”模块，再点击“Differential genes analysis ”选项选择肿瘤名称进行分析。其次，在GEPIA数据库的“Single Gene Analysis”模块下，选择“Boxplots”选项，输入基因名称和肿瘤名称进行差异表达分析，其结果以箱式图呈现。UALCAN数据库页面点击“TCGA”模块，输入基因名称并选择肿瘤名称，在“Expression”模块下选择样本类型，检索出TUBG1基因在LIHC（n=371）与正常对照组（n=50）中的差异表达。GEPIA数据库中设置|log2FC| Cutoff为1、p-value Cutoff 为0.01，为差异表达基因筛选标准，分析TUBG1基因在369例肝癌样本和160例正常样本中的差异表达数据。

1.3 分析TUBG1基因与临床病理特征的相关性基于UALCAN数据库“Expression”模块下，逐一选择肿瘤分期、患者种族、性别、年龄、体重、肿瘤分级进行分析。

1.4 分析TUBG1基因表达与患者的预后关系通过GEPIA数据库的“Survival”模块输入基因和肿瘤名称，高低表达组以中位值进行分组，分析TUBG1基因对LIHC患者总生存期（Overall survival，OS）和无病生存期（Disease free survival，RFS）的影响。

1.5 TUBG1与互作蛋白的相关性分析以及功能富集分析 经STRING数据库构建相关蛋白网络图，在线检索出与TUBG1有紧密关系的蛋白，并进行功能富集分析。检索参数设置：最高可信度设置为0.7，最大交互数设置为20，其余参数为默认。TUBG1及其相关基因利用DAVID数据库进行功能富集分析。

1.6 统计学方法 数据分析采用各个数据库默认参数进行统计学分析。采用Wilcoxon检验分析TUBG1基因在不同肿瘤组织和相邻正常组织中的表达；使用单因素方差分析TUBG1基因在肝细胞肝癌组织与正常对照组织中的表达；采用Logrank检验分析TUBG1基因高、低表达组的生存率。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1TUBG1基因在不同肿瘤组织中的表达TIMER 2.0数据库分析显示，TUBG1基因除在少数癌症组织中低表达外，在包括LIHC的多种癌症中高表达（图1）。

图1 TUBG1基因在不同肿瘤组织和相邻正常组织中的差异表达

2.2TUBG1基因在LIHC组织和正常对照组织中的差异表达 GEPIA和UALCAN数据库均显示，TUBG1基因在LIHC中的表达高于在正常对照组（P＜0.05）（图2）。

图2 TUBG1基因在LIHC和正常组织中的差异表达

2.3TUBG1基因与临床特征的相关性 UALCAN数据库显示，与正常对照组相比，TUBG1的表达量与肿瘤分期、患者种族、性别、年龄、体重、肿瘤分级有关（P均＜0.05），Ⅳ期患者的组别除外（P＞0.05）；在Ⅲ期肝癌患者中，TUBG1的表达水平较Ⅰ期肝癌患者升高（P＜0.05）；TUBG1在亚洲人种患者中的表达量高于白种人（P＜0.05）；正常体重患者TUBG1的表达量高于极重患者（P＜0.05）；肿瘤3级中TUBG1的表达水平高于肿瘤2级（P＜0.05）（图3）。

图3 UALCAN数据库中TUBG1在不同临床病理特征中的差异表达

2.4TUBG1基因表达与患者的预后关系 使用GEPIA数据库分析TUBG1基因与临床预后的关系，以中位值对高低表达患者进行分组，结果显示，在肝细胞肝癌患者中TUBG1高表达者的总生存率和无病生存率均低于低表达者（P＜0.05）（图4）。

图4 TUBG1表达与LIHC患者预后的关系

2.5TUBG1基因其编码蛋白与互作蛋白的相关性分析以及功能富集分析 经STRING数据库构建蛋白互作关系网络图，筛选出NINL、RLK1、HAUS6、BRCA1、CDK5RAP2、NEDD1、MZT1、PLK4、TUBGCP3、MZT2A、CENPJ、NME7、TUBGCP6、TUBGCP5、MZT2B、RPGR、TUBG2、TUBGCP2、TUBGCP3、ACTG1共20个与TUBG1存在紧密关系的蛋白（图5）。将他们经DAVID数据库功能富集分析发现，他们主要参与微管成核、微管细胞骨架组织、有丝分裂细胞间期等过程；具有蛋白结合、细胞骨架的结构成分等分子功能；涉及γ微管蛋白复合物、中心体、纺锤体、细胞质基质等细胞组分（表1）。

表1 TUBG1及其相关基因功能富集分析

图5 LIHC中TUBG1的互作蛋白关系网络图

3 讨论

肿瘤细胞通过无限的有丝分裂大量增殖，而有丝分裂的过程需依靠中心体、纺锤体参与以及微管有序的动态变化。微管蛋白γ1是编码微管蛋白超家族的一个成员，是有丝分裂中心体形成的关键蛋白。该蛋白介导微管成核、参与有丝分裂纺锤体组装以及中心体复制，在微管细胞骨架的组织中起核心作用，是微管形成和细胞周期进展所必需的。因此，微管蛋白γ1在肿瘤细胞的增殖生长中起关键作用。研究发现，微管是一种动态的丝状细胞骨架蛋白，也是中心粒的主体分子，微管纤维的有序性是细胞进行有丝分裂的重要保证［7］。邹翔等［8］发现，使用微管抑制剂能起到抗肿瘤的作用，其机制是通过促进或抑制微管的聚合破坏微管的动态平衡，阻碍肿瘤细胞纺锤体形成，阻滞细胞分裂进程，从而发挥其抗肿瘤作用。VINOPAL S等［9］发现，在人骨肉瘤细胞(Human osteosarcoma cell，U2OS)中，通过RNAi耗竭微管蛋白γ1可导致微管成核受损和中期阻滞。CORVAISIER M等［10］研究发现，γ微管蛋白位置的改变可确保细胞存活并保持基因组完整性，且有助于增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen，PCNA）向细胞质募集，通过这种机制，γ微管蛋白网络通过充当PCNA从胞浆运输到染色质的支架维持肿瘤细胞的无限增殖。TUBG1不仅在各种癌症中有所表达，也能导致微管病的发生。YUEN Y T K等［11］发现，负责细胞微管的TUBG1如果发生突变，其编码的微管蛋白突变会引起大脑异常、小头畸形、早发性癫痫和运动障碍。由此可见，TUBG1在肿瘤发生发展中发挥重要作用，具有十分重要的研究价值。

与TUBG1有紧密关系的RLK1、CDK5RAP2、NEDD1等20个蛋白，经过功能富集分析发现，他们共同参与了微管成核、微管细胞骨架组织、有丝分裂细胞间期等过程。已有研究发现，PLK1经过反义寡核苷酸处理后可抑制PLK1表达，转染PLK1反义寡核苷酸的细胞中心体模糊、扩大，这提示可能出现了γ微管蛋白的解聚和中心体的解体，说明PLK1的表达会影响γ微管蛋白合成中心体［12］。有研究报道称，微管成核需要γ微管蛋白及其招募蛋白GCP-WD/NEED1和CDK5RAP2，他们将γ微管蛋白锚定在中心体上［13］。另外，NEED1被发现其与γ微管蛋白复合体的成分组合，并以该复合体为目标，进而与中心体和纺锤体相结合［14］。NEED1缺失会导致中心体γ微管蛋白环复合体丢失，并导致微管成核和纺锤体组件失败。可见这些基因都与微管、中心体、纺锤体的合成有关，参与肿瘤细胞的有丝分裂。在肝细胞肝癌中，我们发现了他们也与TUBG1密切相关，且都是正相关。因此，TUBG1基因在肝细胞肝癌组织中的高表达可能是他们共同作用的结果。TUBG1在不同肿瘤和疾病中的作用机制不相同，基于本文的数据可以看出，TUBG1与肝细胞肝癌的发生发展有一定联系，但其具体作用机制还不清楚，仍需深度地进行研究。

综上所述，TUBG1在肝细胞肝癌中高表达。TUBG1与肿瘤分期、患者种族、性别、年龄、体重、肿瘤分级密切相关（P均＜0.05）；且生存分析表明，在肝细胞肝癌患者中，TUBG1高表达者总生存率和无病生存率均低于低表达者（P＜0.05）。由此可见，高表达的TUBG1可能是肝细胞肝癌患者预后的不良因素；另外，RLK1、CDK5RAP2、NEDD1与TUBG1密切相关，TUBG1基因在肝细胞肝癌组织中的高表达可能是他们共同作用的结果。本文可为进一步研究肝细胞肝癌的发病机制提供思路。