马齿苋多糖抗CCl4诱导的小鼠慢性肝纤维化作用

李小花，曹性玲，刘四君，曹思，钟桂香，黎晓，吴丽珍

（1.赣南医学院资产管理处；2.赣南医学院基础医学院；3.赣南医学院第一附属医院；4.赣南医学院教务处，江西 赣州 341000）

肝纤维化是肝脏对慢性损伤的一种修复反应，表现为肝细胞发生持续、反复的坏死或炎症刺激，大量纤维增生同时伴有纤维降解的相对或绝对不足，细胞外基质（Extracellular matrix， ECM）在肝内大量沉积并演变为肝硬化［1-3］，最终发展为肝癌。近年来研究发现人和动物肝纤维化具有逆转恢复的可能性［4-5］，而肝癌是不可以逆转的，治疗非常困难，因而抓住治疗关键期，干预和逆转肝纤维化是预防肝癌发生的重要途径。目前肝纤维化有效治疗药物非常有限，西药治疗效果不佳，且不良反应大；中药温和不良反应小，近年来大力提倡开发中药潜力。

马齿苋为马齿苋科马齿属草本植物，已收入《中华人民共和国药典》，药典记载其味酸性寒，归肝，大肠经，具有清热解毒，凉血止血的效果。马齿苋的主要成分是生物碱、多糖、黄酮等，其中多糖类是有效活性成分之一，具有抗肿瘤、降血糖、调血脂、抗氧化、提高免疫力、调节肠道菌群、延缓衰老、镇痛、减轻心肌缺血再灌注损伤等作用［6-13］。马齿苋提取物对辐射、药物、四氯化碳（CCl4）所致的急慢性肝损伤具有保护作用［14-15］，此外，研究还发现马齿苋多糖（Purslane Polysaccharide， POP）通过干扰氧化功能、诱导癌细胞凋亡等发挥抗癌作用［16］。以上证据表明，POP可能逆转肝纤维化的进展。本研究拟采用CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型，明确POP是否逆转肝纤维化的进展，并探索其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SPF级昆明小鼠72只，鼠龄8 W，体质量20～25 g，购自南方医科大学，许可证号：SCXK（粤）2016-0041。小鼠自由进食和饮水，适应性饲养7 d。饲养环境温度18～20 ℃，相对湿度50%～60%，自由光照，持续通风换气。

1.2 药物与试剂 马齿苋多糖粉剂购自扶风斯诺特生物科技有限公司（批号：SNT200518），纯度为50%。联苯双酯（Dimethyl diphenyl bicarboxylate，DDB，国药准字H32026034）购自江苏鹏鹞药业有限公司。PBS磷酸钾缓冲液（Hyclone，批号：SH30256.01B）。HE染液套装试剂盒购自于博奥森生物科技有限公司。引物合成（北京天一辉远生物科技有限公司）。α-平滑肌动蛋白（Alpha smooth muscle actin， α-SMA）一抗（ab5694）购自Abcam公司。GAPDH一抗（MA515738）和羊抗兔二抗（SA24591）购自Thermo Fisher公司。小鼠透明质酸（Hyaluronic acid， HA）（FT-P9S1081X）和层黏连蛋白（Laminin， LN）（FT-P9S633X）ELISA试剂盒购自上海梵态生物科技有限公司。Ⅲ型前胶原-N（Procollagen type Ⅲ-N， PⅢNP）（CS-E02451）ELISA试剂盒购自上海莼试生物技术有限公司。电镜固定液购自Servicebio公司（G1102）。高效RIPA组织快速裂解液（R0010）、PMSF（10 mM， P0100）、30%丙烯酰胺（A1010）、Tris（T8060）、甘氨酸（G8200）、十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate， SDS， S8010）和5×蛋白质上样缓冲液（含DTT）（P10）40均购自Solarbio公司。BCA试剂盒（WB319945）Prestained Protein Ladder（011113447） 、PVDF膜（88520）、增强化学发光试剂（WC323101）、反转录试剂盒（00762290）均购自Thermo Fisher公司。

1.3 仪器 透射电子显微镜（hitachi， HT7800/HT7700），钻石切片刀（Daitome， Ultra 45°），超薄切片机（Leica， Leica UC7）。核酸蛋白测定仪（BioPhotometer plus， 艾本德），流式细胞仪（BD calibur），酶标仪（Thermo Fisher Scientific， multiscan MK3），倒置光学显微镜（OLYMPUS CKX41， UCTR30-2），定量PCR（Invitrogen公司，ABI PRISM®7500 Sequence Detection System）。

1.4 方法

1.4.1 建立肝纤维化模型及给药 SPF级雄性昆明小鼠，随机分成6组：对照组、模型组、DDB（2.5 mg·kg-1）组、低剂量（25 mg·kg-1） POP组、中剂量（50 mg·kg-1）POP组、高剂量（100 mg·kg-1）POP组，每组12只。采用10% CCl4橄榄油溶液制作小鼠病理模型，除对照组外均以10 mL·g-1体重腹腔注射10% CCl4油溶液，对照组注射等体积的橄榄油，每周2次，连续6周。造模同时，各组小鼠分别给予生理盐水、DDB（0.25 mg·mL-1）、POP（2.5、5、10 mg·mL-1）灌胃，体积为10 mL·kg-1体重，如遇到需要腹腔注射CCL4的当天，间歇30～60 min后灌胃，持续6周。

1.4.2 肝组织形态学观察 小鼠给药6 W后，1%浓度的戊巴比妥钠按5 mL·kg-1剂量腹腔注射，动物麻醉后处死，取5 mm×5 mm×5 mm肝组织，10%甲醛固定，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，HE染色，400倍显微镜下观察肝组织病理形态学变化。

1.4.3 电镜观察 取1 mm×1 mm×1 mm肝组织，经固定、脱水和包埋，树脂块于超薄切片机60～80 nm切片，150目铜网捞片。2.6%枸橼酸铅溶液避二氧化碳染色8 min；超纯水洗3次，滤纸稍吸干，切片放入铜网盒内室温干燥过夜。透射电子显微镜下观察，采集图像分析结果。

1.5 ELISA检测 小鼠内眦取血，3 000×g离心5 min，取血清于-80 ℃冻存。准备好所有需要的试剂及工作浓度标准品。按照试剂盒说明操作，在30 min之内，酶标仪测量405 nM波长范围吸光度，根据标准曲线计算目标蛋白含量。

1.6 qPCR 检测 取各组小鼠肝组织约20 mg，提取总RNA，用Oligo dT反转录，采用博奥森生物科技有限公司购置的PCR试剂盒扩增，引物由天一辉远生物科技有限公司合成，引物序列如表1。采用相对定量法检测小鼠肝脏组织中ColLAGEN Ⅲ、Smad4、TGF-β1和ɑ-SMA的mRNA表达水平，以18sRNA为内参，运用2-ΔΔCT方法计算各组mRNA的相对表达含量。qPCR扩增体系为20 µL，包括2x SYBR Green qPCR SuperMix 10 µL，上下游引物各0.5 µL，基因组DNA（1∶20稀释）5.0 µL，ddH2O 4.0 µL。反应条件和溶解曲线分析参考试剂盒说明书设定温度、时间和循环次数。

表1 检测基因引物序列表

1.7 Western blotting 检测 取各组小鼠肝组织约50 mg，用含有PMSF的高效RIPA裂解提取总蛋白，BCA方法行蛋白定量。将等量（约20 µg）的总蛋白加入到10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳，然后将胶中的蛋白在Tris-甘氨酸转移缓冲液中转移到PVDF膜上。将膜在室温下用5%脱脂牛奶封闭1 h，与GAPDH（1∶1 000）、或α-SMA（1∶1 000）一抗孵育，4 ℃过夜。山羊抗兔二抗（1∶5 000）在室温下孵育1 h。将化学发光试剂盒中的两种试剂按1∶1比例混合，与PVDF膜孵育1 min，AI600化学发光成像系统对条带进行检测及分析。

1.8 统计学方法 应用Prism 8.0统计学软件进行统计学分析。各测量指标的数据资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析与多重比较相结合方法，组间各测定指标的总体比较用单因素方差分析，Tukey检验对组内各指标行多重比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝组织病理形态学变化 HE染色结果显示，对照组小鼠肝小叶结构完整，肝细胞索状排列分布呈放射状，未见细胞空泡样变性及炎性细胞浸润；模型组小鼠可见肝细胞水肿及空泡样变性，炎症反应明显，可见较多炎症细胞，核深染，少量纤维化增生；DDB组与POP高剂量组小鼠肝小叶结构完整，见少量空泡样变性及坏死细胞，炎症反应不明显，少见炎症细胞。POP低、中剂量给药组小鼠肝损伤与模型组相比均有不同程度改善，部分可见细胞水肿变性，散在少许炎性细胞浸润。POP给药各组病理改变均比模型组有所减轻，表现出随剂量作用增强的趋势（图1）。

图1 小鼠肝组织病理变化（HE×400）

2.2 肝组织形态学改变电镜结果 对照组血管内皮结构完整，结构清晰，线粒体饱满，内质网结构丰富。模型组结构不清，细胞核增大，常染色质数量异常增加，线粒体和内质网等细胞器代偿性增多，脊增多或断裂，有少许空泡，DDB组细胞核呈卵圆形，核膜正常厚度，可见均匀分布的染色质，胞浆内线粒体较多。随着POP给药浓度梯度增大，各给药组细胞形态结构渐变清晰，细胞核及线粒体等细胞器大小趋向正常，核染色质分布均匀，细胞间质内有少量胶原存在，且上述状态均较模型组减轻（图2）。

图2 小鼠肝组织细胞电镜特征（×2 000）

2.3 马齿苋多糖对小鼠肝纤维化相关基因表达的影响 慢性肝纤维化模型组小鼠肝组织CollagenⅢ、ɑ-SMA、TGF-β1和Smad4 mRNA表达水平增高；POP治疗组上述基因表达呈剂量依赖性下降，以高剂量效果最好（图3）。

图3 马齿苋多糖对小鼠慢性肝纤维化相关基因表达的影响

2.4 马齿苋多糖对小鼠肝纤维化相关蛋白表达的影响 模型组血清肝纤维化相关蛋白LN、HA和PⅢNP显著提高，提示肝纤维化模型造模成功，POP给药组HA、LN、PⅢNP均显示剂量依赖性下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）。Western blot检测结果发现，模型组α-SMA表达水平明显增高，POP给药组α-SMA表达明显下降（图4）。

图4 马齿苋多糖对小鼠慢性肝纤维化相关蛋白表达的影响

3 讨论

研究已证实，去除损伤因素并进行保肝治疗后，肝纤维化具有可逆性［17］，为进一步研究肝纤维化药物治疗提供了重要的理论依据。本研究采用CCl4建立小鼠慢性肝纤维化病理模型，模型组小鼠形态学与电镜结构改变均提示造模成功。POP不同剂量给药组病理形态及细胞结构得到改善，与纤维化相关蛋白和细胞因子的下调呈现规律相关性，表明POP对CCl4诱导的肝纤维化具有逆转效果，为揭示POP抗纤维化机制研究提供了依据。

肝纤维化形成的主要原因已经证实与Ⅰ、Ⅲ型胶原在肝组织沉积有关［18］，故大多数药物的作用原理通过降解胶原蛋白减轻肝纤维化，促进肝细胞再生实现。本研究发现，POP治疗组Collagen Ⅲ的mRNA呈浓度依赖降低，伴随着肝组织形态学炎症病理的好转，电镜下细胞线粒体与细胞核结构逐步恢复，提示POP可能通过降低胶原蛋白异常沉积达到抗纤维化作用，与安祯祥等［19］研究机制吻合。

慢性肝纤维化表现为组织异常增生和肝星状细胞活化并分泌胶原蛋白、HA、LN、PIIINP为特征［20］，同时伴肌成纤维细胞的标志物α-SMA的mRNA和蛋白表达升高［21］。本研究发现，POP治疗组肝组织HA、LN、PⅢNP含量降低，提示其可抑制肝星状细胞的活化；α-SMA的mRNA和蛋白水平均较模型组降低，提示POP可减慢成纤维细胞活化并逆转肝纤维化。

细胞因子对肝纤维化病理发生发展有重要影响，其中转化生长因子（Transforming growth factor，TGF）是肝纤维化发生发展过程中的重要分子。TGF-β1为多功能簇蛋白多肽，是促纤维化作用始动因子，可促进肝细胞分泌胶原蛋白，加速激活肝星状细胞的活化。TGF-β主要通过下游信号分子Smad通路的激活，参与肝纤维化的进展［22-24］，因此，减少TGF-β1和Smads表达可以改善肝纤维化［25-26］。本研究发现，POP治疗后，TGF-β1和Smad4 mRNA表达下调，提示POP的抗诱导的肝纤维化作用可能是通过抑制TGF-β/Smad信号通路实现的。

综上所述，POP具有抗肝纤维化作用，其机制可能通过下调TGF-β/Smad信号通路，调控α-SMA及胶原蛋白表达，减少细胞外基质和胶原蛋白沉积实现。