CPEB3在人舌鳞状细胞癌组织中的表达及与临床病理特征相关性分析

葛 翔,裴文浩,朱永娜,王 敏,张 凯

头颈部癌在全球恶性肿瘤中位居第六位[1],其中头颈部鳞状细胞癌(HNSC)的发生率较高。口腔鳞状细胞癌(OSCC)是头颈部最常见的恶性肿瘤,其发病率在多个国家呈上升趋势[2],而舌鳞状细胞癌(TSCC)约占OSCC的30%[3],因其恶性程度高、局部复发率高、颈部转移率高的特点,总体生存率仅为50%～60%[4]。目前综合治疗方法包括手术、放疗和化疗,术后多具有不可逆的口腔功能缺失[5-6],且上述治疗没有显著延长病人的生存时间[7-8]。靶向治疗是近年来另一治疗途径,通过对癌症相关基因和信号通路的研究,有助于靶向药物的研发,提高TSCC病人生存率。胞质多聚腺苷化元件结合蛋白3(CPEB3)在结肠癌、肝癌、胃癌、子宫颈癌等多种肿瘤中异常表达,影响癌症的进展[9]。目前对于CPEB3在TSCC组织中的表达以及与临床病理之间的相关性尚无报道。本研究通过检测TSCC组织中CPEB3的差异表达及调控,分析其与临床病理特征的关系及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2016年6月至2020年12月蚌埠医学院第一附属医院口腔科手术切除且经病理科存档的TSCC组织及癌旁组织标本75例,其中男52例,女23例;年龄24～84岁;根据美国肿瘤联合会第8版口腔癌分期标准TNM法[10],其中TNM Ⅰ期26例,Ⅱ期15例,Ⅲ期15例,Ⅳ期19例;病理分级高、中、低分化分别为43例、24例、8例;淋巴结阳性30例,淋巴结阴性45例。纳入标准:(1)原发肿瘤部位为舌,病理诊断为TSCC;(2)无远处转移;(3)术前未行放化疗等相关治疗史。排除标准:(1)有其他恶性肿瘤史;(2)临床及病理资料不全者。本研究经蚌埠医学院伦理委员会批准(伦科批字[2021]第250号)。

1.2 免疫组织化学染色 组织标本经 40 g/L甲醛固定,常规石蜡包埋,用切片机连续切片。获得5张厚4 μm的切片,使用EnVision两步法进行免疫组织化学染色。以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗为阴性对照。切片经常规脱蜡水化、过氧化氢封闭内源性过氧化物酶和柠檬酸缓冲液抗原修复,加羊血清封闭;加入兔抗CPEB3 抗体(proteintech公司,1∶200),4 ℃冰箱过夜;PBS洗涤后,室温复温30 min;PBS洗涤,加HRP标记的山羊抗兔IgG(affinity公司,1∶500),室温孵育30 min;洗涤,DAB(塞维尔生物科技有限公司)显色;苏木精复染、分化、脱水、透明、封片。具体实验步骤严格按照说明书进行。

免疫组织化学染色结果分别由两位经验丰富的病理科医生在显微镜下观察并计算染色强度和阳性染色的细胞比例。CPEB3染色强度计分标准:无色或与背景色一致为阴性,为0分,细胞核内出现黄色记为1分,细胞核内出现棕黄色记为2分,细胞核内出现棕褐色记为3分。阳性染色的细胞比例计分标准:未染色为0分,1%～25%阳性为1分,>25%～50%为2分,>50%～75%为3分,>75%为4分。染色强度计分和阳性染色的细胞比例计分之和即为CPEB3表达的总评分。总评分0～2分为低表达,3～7分为高表达。记录CPEB3在癌组织和癌旁组织中的总评分[11]。

1.3 生物信息学分析 利用癌症基因组图谱(TCGA)数据库,通过UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu)分析CPEB3在HNSC组织中的差异表达及其与临床特征的相关性。

1.4 统计学方法 采用t检验、方差分析、q检验和χ2检验。

2 结果

2.1 HNSC组织中CPEB3的表达下调 为分析CPEB3在HNSC组织中差异表达情况,从TCGA数据集获得了503个HNSC的数据和相应的临床信息,对照组44例良性病例组织样本的数据同样来自TCGA数据库。生物信息学分析结果显示,CPEB3在HNSC组织中的表达量(1.63±0.59)明显低于正常组织(2.66±0.63)(t=10.98,P<0.01)。

2.2 CPEB3的表达与HNSC病人的临床分期和分化的相关性 利用TCGA数据库进一步分析CPEB3表达的临床意义,结果显示,与正常组织相比,CPEB3在不同分期和分化程度的HNSC病人中表达量降低(P<0.05)(见表1)。

表1 TCGA数据库中HNSC病人CPEB3的表达量与临床病理相关性

2.3 低表达CPEB3的HNSC病人预后较差 为探讨CPEB3表达与HNSC病人生存的关联性,利用UALCAN数据库分析,结果显示,CPEB3低表达的HNSC病人,其3年生存率低于CPEB3高表达的病人(P<0.05)(见表2)。

表2 TCGA数据库中HNSC病人3年生存情况分析(n)

2.4 CPEB3在TSCC组织中低表达 为进一步分析CPEB3表达与TSCC临床病理的相关性,采用免疫组织化学染色检测TSCC组织及其癌旁组织中CPEB3蛋白的表达水平,结果显示,与癌旁组织相比,CPEB3在TSCC组织中低表达(P<0.01)(见图1、表3)。

表3 CPEB3在TSCC组织与癌旁组织中的表达情况(n)

2.5 TSCC病人中CPEB3表达与临床病理特征的相关性分析 CPEB3的表达与TSCC病人的性别和年龄无明显相关性(P>0.05),而与TNM分期、病理分级和淋巴结转移有相关性(P<0.05～P<0.01)(见表4)。

3 讨论

全球每年约有37.31万OSCC的新发病例和19.94万人死亡相关病例[12],吸烟、饮酒和咀嚼槟榔是OSCC的主要致病因素[13-15]。TSCC是OSCC的一种主要类型,具有极强的侵袭性和低生存率的特点[16-17]。研究[18-19]表明,TSCC初诊时即有较高的淋巴结转移,从而导致预后较差,咀嚼和吞咽功能障碍。目前,临床主要治疗方法是多模式治疗,包括手术、放射和化疗。尽管目前的治疗方法取得了进展,但TSCC的死亡率仍然很高[20]。因此,确定其发生发展的分子机制,获得新的靶点有利于TSCC的早期诊断和靶向治疗。

表4 CPEB3表达与TSCC病人临床病理特征相关性(n)

CPEB家族在躯体组织的细胞内稳态的调控中具有重要作用,包括突触可塑性、细胞增殖、极性和衰老[21]。CPEB家族有4个成员:CPEB1、CPEB2、CPEB3和CPEB4[22],CPEB3是细胞质多聚腺苷基化的重要调节因子[23],调节蛋白质的翻译,在多种癌症中都发现了CPEB3的异常表达[24],在结肠癌[25]、胶质瘤[26]、肝癌[27-28]、结直肠癌[29]、胃癌[30]、子宫颈癌[31]、乳腺癌[32]的表达明显低于正常组织。研究[27]发现CPEB3可与谷氨酸受体GluA1和GluA2结合并抑制其合成,从而抑制癌细胞的上皮间质转化,CPEB3基因的敲除取消了沉默的TRIM11对癌细胞增殖能力的抑制作用[30],表明CPEB3在癌细胞的发生发展中可能发挥抑癌基因的作用。

本研究首先利用TCGA数据库,通过生物信息学分析,发现与正常组织相比,CPEB3在HNSC中表达显著降低,CPEB3的降低与HNSC临床分期及分级有关,并与病人的不良预后显著相关,CPEB3低表达的病人术后总生存期缩短。而OSCC是头颈部最常见的恶性肿瘤,TSCC是OSCC的一种主要类型。因此,本研究进一步收集临床TSCC病人的癌组织和癌旁组织样本,通过免疫组织化学染色分析CPEB3的表达及与临床病理特征的相关性,结果表明,CPEB3在TSCC中的表达量与病人性别和年龄无明显相关性,与淋巴结转移、分化程度及TNM分期有显著相关性,这一结果与生物信息学分析结果一致。

综上所述,CPEB3在TSCC中的表达明显低于癌旁组织,且CPEB3的表达与淋巴结转移和TNM分期呈负相关关系,而与分化程度呈正相关关系,CPEB3与TSCC肿瘤细胞的转移和侵袭有关。有研究[33-34]证实,CPEB3可通过抑制表皮生长因子受体的表达,抑制神经胶质细胞瘤、卵巢癌细胞、肝癌细胞的迁移和侵袭。因此,CPEB3可能为TSCC预后评估和治疗的潜在生物标志物。本研究仅从组织水平研究了CPEB3在TSCC中的表达以及相关性,但CPEB3通过何种途径抑制TSCC肿瘤的发生及其调控机制有待进一步研究。