HPV感染型别及多重感染与女性宫颈病变的关联性分析

徐露露,张 琴,孙 梅

妇女宫颈癌的发病率在全球范围内仅次于乳腺癌,属于妇科最常见的生殖系统恶性肿瘤,严重威胁女性的健康和生命[1-3]。据统计,全球每年新增宫颈癌病例约50万例,死亡28万例,我国的新增宫颈癌病例13.5万例,死亡8万余例[4]。宫颈癌的预防和治疗至关重要,是当今世界特别是发展中国家的研究热点[5-6]。不同宫颈病变中存在多种人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染是不争的事实,且HPV感染的发生比例较高。然而,宫颈癌的预防和治疗中,明确多发感染在宫颈癌病变、宫颈癌发展和预后中的作用是必要的,不仅需要确认多发性感染在宫颈病变中是否起着相同的作用,还要以更多病例及区域,从不同的方向进行研究分析[7]。掌握多重感染对宫颈病变发展和预后的影响,可以为宫颈癌的预防和治疗提供更多理论依据,制定更加完善的癌症预防计划,还可以为宫颈病变的预测以及预后评估提供可靠依据,为临床治疗方案的选择提供参考[8-10]。基于此,本研究选取接受HPV分型检查以及液基薄层细胞学检查(thin-prep cytology test,TCT)的检测样品进行回顾性分析,观察HPV感染型别及多重感染情况,分析不同HPV感染型别病人的宫颈病变情况,明确HPV感染型别及多重感染与女性宫颈病变的相关性。现作报道。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2018-2020年我院进行HPV分型检查以及TCT的6 000份检测样本为研究对象。病人年龄22～68岁。入组标准:(1)对此次研究知情并签署研究同意书;(2)有性生活史;(3)非妊娠期或哺乳期。排除标准:(1)有妇科恶性肿瘤病史;(2)有子宫全切术、宫颈环形电切术史;(3)样本质量问题最终剔除。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 由临床医生使用凯普HPV采样刷采集宫颈脱落细胞标本,将毛刷放入加有专用细胞保存液的收集管中,4～8 ℃冰箱保存,3 d内完成检测。取材时要求月经干净期,48 h内无性生活史,白带清洁度检查正常,检查前3 d不得使用阴道内药物或阴道冲洗。

1.2.2 TCT 由妇科医生使用窥器打开阴道暴露宫颈,并用宫颈刷在宫颈鳞柱交界部顺时针转动5～10圈,获得宫颈脱落细胞,再将细胞样本送检,使用TCT细胞学检测仪检查。根据国际癌症协会推荐的TBS分类,分为:正常和炎症(WNL)、意义不明不典型鳞状上皮细胞(ASCUS)、腺原位癌(AIS)、未见上皮内病变或恶性细胞(NILM)、低度鳞状上皮内病变(LSIL)、高度鳞状上皮内病变(HSIL)、鳞状细胞癌(SCC)、反应性细胞改变,以上示TCT结果为阳性。

1.2.3 HPV-DNA分型 仪器与试剂:HPV基因分型检测试剂盒,由潮州凯普生物化学有限公司生产,对HPV基因型进行分型检测,包括13种高危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)和8种低危型HPV(6、11、42、43、44、66、81),共21种。凯普全自动核酸提取仪,Applied Biosystems PCR仪(型号Veriti DX96well),凯普医用核酸分子杂交仪。

实验步骤和结果判读:(1)样本处理,使用凯普全自动核酸提取仪对样本核酸提取及HPV阳性和阴性质控品的处理。(2)试剂配制,用PCR反应液1和PCR反应液2配制测试反应体系。(3)上样,在各对应的反应管中加入1 μL的HPV阴性质控品、HPV阳性质控品、样本处理上清液,盖紧反应管后进行检测,PCR扩增条件为20 ℃、10 min,95 ℃、9 min,各进行1个循环;95 ℃、20 s,55 ℃、30 s,72 ℃、30 s,进行40个循环;72 ℃、5 min,4 ℃、10 min,各进行1个循环。(4)杂交,按照说明书将杂交液与PCR产物在杂交仪内进行导流杂交;用酶标进行显色。(5)结果判读,根据芯片显色位点判断HPV基因型。

1.2.4 宫颈病变常规诊疗及组织病理学检查 在常规宫颈病变诊疗的基础上,对部分高危型病人采用宫颈组织病理检查确定,使用电子数码阴道镜(金科威公司)实施阴道镜下宫颈组织活检,以宫颈活检病理检查为金标准,具体检查方法:对病人的外阴阴道宫颈、活检钳进行消毒,依据病人的病变部位及情况,用活检钳于病变部位取几小块组织,将其置于浓度为10%的甲醛溶液中固定,送病理科做切片染色后作出病理诊断。宫颈病变分为慢性炎症疾病、宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ级、CINⅡ～Ⅲ级和宫颈癌。

1.3 统计学方法 采用χ2检验和logistic回归分析。

2 结果

2.1 HPV感染基因型别及与宫颈病变情况 6 000份HPV检测样本中,1 034份为HPV阳性,阳性率为17.23%;HPV感染病人中检测出21个基因亚型,其中高危型感染的前三位是HPV16、HPV52和HPV56,低危型感染最多的是HPV6。

2.2 HPV阳性者TCT结果 1 034例HPV阳性者中,ASCUS、LSIL、HSIL、NILM以及反应性细胞改变分别为697例(67.41%)、125例(12.09%)、91例(8.80%)、22例(2.18%)、99例(9.57%)。

2.3 HPV基因型与宫颈病变的关系 经常规宫颈疾病诊疗及阴道镜下宫颈组织病理检查显示,1 034份HPV阳性标本中慢性炎症疾病634份(61.32%),CINⅠ级208份(20.12%),CINⅡ～Ⅲ级128份(12.38%),宫颈癌64份(6.18%)。HPV感染基因型及宫颈病变分布情况见表1。

表1 HPV感染基因型别及宫颈病变分布情况(n)

2.4 影响宫颈癌发生的HPV型别logistic回归分析 排除年龄因素影响后,logistic回归分析显示,HPV16和HPV18感染与宫颈癌发生具有密切关联(P<0.01和P<0.05)(见表2)。

表2 影响宫颈癌发生的HPV型别logistic回归分析

2.5 单一感染及多重感染与宫颈病变关联性分析 1 034份HPV阳性样本中,单一感染761份(73.60%),多重感染273份(26.40%)。不同宫颈病变中的单一感染和多重感染占比比较显示,不同宫颈病变分级病人中大部分为单一感染,且随着病变严重程度的增加,单一感染占比明显上升,多重感染占比降低(P<0.01)(见表3)。

表3 单一感染及多重感染与宫颈病变的关联性[n;百分率(%)]

3 讨论

宫颈癌的发生是一个多因素、多基因、多阶段、多步骤协调的漫长而复杂的过程,其中生物因素是宫颈癌发生的主要原因[11]。世界卫生组织及我国卫生部门的调查统计资料显示,我国宫颈癌发病人数和死亡人数几乎占全球1/5,近年来宫颈癌的发病率和死亡率还在持续上升,并呈现年轻化趋势,形势十分严峻[12-13]。TCT是临床常用的宫颈癌早期筛查方法,也是目前最先进的细胞学检查技术。与传统的巴氏杀菌法相比,TCT可以提高子宫颈癌细胞的样本质量和检出率。同时,TCT还可以在癌前病变中发现一些细胞,并且可以显著减少巴氏杀菌的重复次数,因此病人接受度更好[14]。近几年针对宫颈癌发病因素的研究,多集中于HPV感染方面。检测HPV指标,已经成为宫颈癌的常规筛查手段。该检测方法的敏感度较高,且具有着较高的可重复性,针对低级别的CIN也具有较高的特异度。

HPV感染型别中,HPV16和HPV18是影响女性宫颈病变发展速度的高风险因素,同时与多重感染、女性宫颈病变也有着明显相关性。宫颈病变病人中HPV多重感染发生较少,主要是以单一感染为主。HPV16和HPV18是最常见的HPV致癌亚型。本研究中,HPV感染病人中检测出的基因亚型为21个,其中高危型感染的前三位是HPV16、HPV52和HPV56,低危型感染最多的是HPV6;邓六六等[15]选取22 234例子宫颈癌筛查病人进行分析,发现最常见的HPV感染高危亚型是HPV52、HPV58和HPV16,这一结果与此次研究结果有一定一致性,也存在一定差异,这可能是受到研究对象地区等因素的影响。陈炜等[16]选取广州地区作为研究地,通过基因芯片技术检测与病理活检分析HPV感染型别及其和宫颈癌的相关性,发现最常见的高危型基因分型是HPV16,且证实HPV感染和宫颈癌具有密切相关性。这也与本研究结果具有一致性,本研究logistic回归分析结果显示,HPV16和HPV18感染型别与宫颈癌发生密切关联。尽管不同地区的HPV基因型别可能存在一定差异,但总体来看,HPV16是我国最为常见的HPV高危基因型别。另外,实际的临床检测与研究中,检测仪器设备等差异会对检测结果产生影响,采样器的长度不能到达子宫颈,会导致测试数据存在一定的误差,或是棉签取样的细胞数量低于刷子取样的细胞数量。这也是导致不同研究人员结果存在一定差异性的原因之一。有研究[17]表明,与HPV16、HPV18在宫颈癌中的比例相比,HPV16、HPV18感染在宫颈癌前病变中的比例明显较低。也有研究[18]表明,多种HPV感染促进子宫颈癌的发生,不同HPV在子宫颈癌中的作用有待进一步阐明。

综上所述,HPV感染的数量与宫颈病变明显相关,HPV基因型别与宫颈癌的癌变程度及宫颈疾病的进展密切相关,其中HPV16和HPV18感染型别与宫颈癌的发生关联更为密切,因此,强化HPV筛查及基因检测对于我国宫颈癌预防具有重要意义。