转录因子E2F1在口腔鳞癌组织中的表达及其临床意义

郭治辰, 龚忠诚, 赵化荣, 买热拍提·买明, 李晨曦

(1西安交通大学口腔医院口腔颌面外科, 2陕西省牙颌疾病临床研究中心, 陕西省颅颌面精准医学研究重点实验室, 西安 710004;3新疆医科大学第一附属医院(附属口腔医院)颌面肿瘤外科, 4新疆维吾尔自治区口腔医学研究所,5新疆医科大学第一附属医院肿瘤中心, 乌鲁木齐 830054)

口腔鳞癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)是常见的头颈部肿瘤之一,发病率高[1-2],具有较高的侵袭性、转移率,预后较差[3]。近年来,OSCC的发病率和死亡率逐渐增高,新增病例数超过30万人,死亡人数超过14万人[4]。虽然目前对于OSCC的治疗手段日益丰富,例如:手术结合放化疗、免疫靶向治疗等均得到了较好的治疗效果,但OSCC患者的5年生存率一直维持在50%左右[5]。从生存和预后的角度考虑,近50年来对OSCC的治疗并没有取得重大的进展[6]。因此,为了提高OSCC的治疗效果和预后,寻找有效的生物标志物是非常迫切的。

转录因子E2F1作为E2Fs基因家族的成员,已被证实其涉及到调控细胞增殖、细胞周期进程、细胞凋亡、自噬、DNA复制、损伤和修复等[7-9]。研究表明,E2Fs家族基因的表达升高与OSCC患者的不良预后相关[10],也有研究证实在人乳头瘤病毒阳性的OSCC组织中E2Fs家族基因的表达显著上调[11]。E2F1在肿瘤发生发展中同样扮演着关键启动角色,在黑色素瘤[12]、肺癌[13]、肝癌[14]、结直肠癌[15]等肿瘤中,均可通过激活下游致癌基因促进肿瘤的进展。目前尚未发现有关于E2F1在OSCC组织中的表达水平以及其对患者预后影响的相关研究报道,也不清楚E2F1在OSCC中发挥了何种生物学作用,因此,鉴于其在多种肿瘤中所扮演的重要角色,在OSCC中对其进行深入研究是十分必要的。

本研究利用免疫组织化学技术检测OSCC组织与癌旁组织中E2F1的表达差异,并分析不同表达水平与OSCC患者临床病理参数间的关系,评价其作为促进OSCC进展的一种新型分子标志物的潜在价值,为进一步研究E2F1在OSCC中的调控机制提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料2018年9月-2022年9月对新疆医科大学第一附属医院颌面肿瘤外科收治的80例OSCC患者的病例资料进行回顾性分析,所有患者均接受外科手术治疗,其中男性47例(59%),女性33例(41%)。纳入标准:(1)所有患者均经病理组织学诊断为口腔鳞癌;(2)随访信息完整;(3)入院前未接受肿瘤相关治疗史。排除标准:合并患有全身其他部位肿瘤。同时收集10例癌旁组织标本(距离肿瘤组织约3 cm处进行取材)。对所纳入的80例OSCC患者均进行了严格的随访,最短随访时间为4.56个月、最长随访时间为60.0个月、平均随访时间为52.2个月,临床病理分级和分期根据美国癌症联合委员会制定的标准确定(中文版第8版)。

1.2 数据收集收集患者信息,包括年龄、性别、肿瘤复发、肿瘤分级、临床分期[16](Ⅰ期:无区域淋巴结和远处器官转移,肿瘤可侵犯少部分周围组织;Ⅱ期:肿瘤可侵犯周围脏器,可发生局部的淋巴结转移,但不会出现远处转移;Ⅲ期:可侵犯肿瘤周围大部分组织及器官,可出现病变部位对侧的淋巴管转移,但并未出现远处转移;Ⅳ期:肿瘤区域淋巴结转移较为严重,出现单个或多个器官多处转移现象,可出现未显示分化倾向的情况)和TNM分期[17](T:原发肿瘤的大小;N:区域淋巴结转移数;M:远处器官转移数)等。随访数据通过电话或病例记录获取。

1.3 组织芯片制备所有病理组织石蜡切片均经2名资深病理科医师确定为OSCC组织,选择肿瘤区域并进行标记,根据标记位置,取一直径为1.00 mm的组织芯片将其连续放置在约2 cm×2 cm大小的蜡块上,形成组织微阵列蜡块。

1.4 免疫组织化学分析使用徕卡MAX自动免疫染色机(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)进行免疫组化染色。组织切片进行脱蜡和复水,在pH值为9的乙醇中加热进行抗原修复20 min。兔多克隆抗体E2F1(bs-23184R,北京博奥森,中国,1∶100)用于免疫组化染色。使用Bond Polymer Refine-HRP检测系统(DS9800, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)进行自动染色。使用DAB显色液进行显色,苏木素进行复染。用Image J软件对图像进行定量分析,将组织芯片E2F1表达水平分为弱阳性或强阳性表达。

1.5 统计学分析采用R(4.2.1版本)和 SPSS(25.0版本)软件进行统计学分析。分类变量以百分比表示,χ2检验用于E2F1弱阳性表达与强阳性表达间的比较。采用单因素和多因素Cox回归分析,估算风险比(HR)和相应的95%置信区间(CI),以确定E2F1表达与死亡之间的关系。Kaplan-Meier法用于比较生存结果。以P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 E2F1在OSCC及癌旁组织中的表达及与临床病理参数的关系E2F1在癌旁组织中为阴性表达,在口腔鳞癌组织中为阳性表达,差异具有统计学意义,见图1。E2F1强阳性表达与弱阳性表达在T分期、临床分期和生存状态上的差异有统计学意义(P<0.05);在性别、年龄、分化程度、N分期、是否复发上的差异无统计学意义,见表1。

注:A,D:E2F1在癌旁组织中为阴性表达;B,E:E2F1在OSCC组织中强阳性表达;C,F:E2F1在OSCC组织中弱阳性表达。

表1 E2F1的不同表达水平与OSCC患者临床病理参数的关系/例(%)

2.2 80例OSCC患者的预后分析将E2F1作为自变量进行单因素Cox回归分析(模型1),结果显示,E2F1强阳性表达是OSCC患者死亡的风险因素[HR=16.464(2.139～126.723)];进一步对T分期、N分期、临床分期、复发等单因素分析P<0.2的指标进行校正并进行多因素Cox回归分析(模型2),结果显示,E2F1强阳性表达是预测OSCC患者死亡的风险因素[HR=17.707(1.969～159.285)]。模型1中不校正任何指标,模型2中校正T分期、N分期、临床分期、复发等指标。见表2、3。

表2 OSCC患者死亡影响因素的单因素Cox回归分析

表3 E2F1的不同表达水平与OSCC患者死亡的相关分析

2.3 E2F1的不同表达水平对OSCC患者生存的影响通过Kaplan-Meier法对E2F1的不同表达水平与OSCC患者的生存进行相关分析发现,E2F1强阳性表达的OSCC患者与E2F1弱阳性表达的OSCC患者相比预后较差(HR=16.464,P<0.001),见图2。

图2 E2F1的不同表达水平对OSCC患者生存的影响

3 讨论

OSCC是头颈部鳞状细胞癌的一种主要类型,也是目前致死率较高的肿瘤之一。近年来OSCC的发病率不断上升,且近5年对OSCC的治疗并无实质性的进展[18]。目前,外科手术切除是早期OSCC患者的主要治疗方法,而放疗或化疗是晚期OSCC患者的首选治疗方法[19],但考虑到OSCC的某些临床症状的非特异性,大多数患者的疾病诊断时期都是处于一个病程较晚的阶段。因此,识别新的OSCC诊断或治疗的分子标志物是至关重要的。本研究结果显示,转录因子E2F1在癌旁组织中为阴性表达,在OSCC组织中为阳性表达。E2F1强阳性表达与弱阳性表达在T分期、临床分期和生存状态上的差异有统计学意义(P<0.05),提示E2F1表达可能在促进OSCC的发生和发展中发挥了重要的促进作用。生存分析也显示E2F1强阳性表达的OSCC患者的预后较差。

细胞周期相关转录因子E2F1是转录因子E2Fs家族成员之一,主要参与细胞周期、DNA复制和修复、细胞分化、增殖和凋亡等多种细胞生物功能[20]。E2F1除了调节正常细胞的细胞周期功能外,在肿瘤发生发展过程中也扮演着重要的角色,E2F1的阳性表达已经在多种肿瘤中被检测到,根据肿瘤的不同部位和不同亚型的情况下,E2F1在其中发挥了某些生物学功能[21]。Li等[22]的研究证实,小细胞肺癌组织中E2F1的表达升高,并证实了E2F1可通过与下游MMP9的启动子区直接结合促进MMP9的转录。Fang等[23]研究发现E2F1与结直肠癌患者的TNM分期相关,本研究中也发现,E2F1的强阳性表达与OSCC的T分期相关。

目前对于肿瘤的研究不仅局限在实体瘤中,肿瘤所处的微环境在整个肿瘤发生发展的过程中也起关键作用,炎症微环境是肿瘤生长的“土壤”,肿瘤免疫微环境中的机制复杂,肿瘤细胞与微环境能够产生相互作用[24]。研究报道E2F1在肿瘤免疫微环境中具有促炎作用,在E2F1敲低的人单核细胞中,能够明显抑制巨噬细胞对脂多糖的应答[25]。本次研究表明E2F1在OSCC组织中的强阳性表达与肿瘤分化、临床分期和预后相关,同时证明了E2F1的强阳性表达是预测OSCC患者死亡的独立危险因素,提示E2F1有可能成为评价OSCC患者预后的一种新型分子标志物。