人巩膜成纤维细胞中miR-184表达与近视发生、发展的关系及其对PI3K-Akt信号通路的调控作用△

张悦之 邓 燕 殷小龙 熊伟伟 于春红

近视防治已成为临床研究的重要方向,因此,深入研究近视发生发展的病理机制对于近视防治具有重要指导意义。近年来,越来越多的研究发现微小RNA(miRNA)在眼部发育、眼科疾病中发挥重要调控作用,miRNA通过调控多种信号通路而参与近视进展过程,并在转录或转录后水平调控基因表达而影响眼部细胞的增殖、分化、凋亡等过程[1-2]。miR-184是晶状体、角膜中含量最高的miRNA,调节干细胞向角膜上皮细胞转化,miR-184的15q22-q24区发生突变(+57C>T)可引起严重圆锥角膜,敲除miR-184则导致PAX6基因表达下调,严重圆锥角膜、PAX6基因表达下调均与近视易感性密切关联[3-4],因此认为miR-184异常表达与近视的发生、发展存在相关性。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信号通路广泛存在于各类细胞中,参与调控细胞生长、增殖、侵袭、能量代谢等生物学过程,其还参与多种眼科疾病的发生、发展,且PI3K-Akt信号通路受到miR-184的调控[5-6]。miR-184在近视发生、发展中的作用机制与调控PI3K-AKT信号通路的关系尚未完全明确,因此,本研究将通过建立人巩膜成纤维细胞模型,探讨miR-184表达与近视发生、发展及PI3K-Akt信号通路的关系,从而为明确近视发病机制提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂与仪器人巩膜成纤维细胞购自中国科学院细胞库。DMEM培养基(批号:AB10110957)、胎牛血清均购自美国Hyclone公司;mimics对照、miR-184 mimic、anti-miR-184均购自美国Gene Pharma公司;转染试剂TurboFect Transfection Regent购自美国Thermo Scientific;PI3K-Akt/雷帕霉素机械靶蛋白(mTOR)通路抑制剂PI-103购自美国Sigma公司;HRP标记山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG均购自北京博奥森生物技术有限公司;RNA提取试剂盒和定量PCR试剂盒均购自大连TaKaRa公司;CCK-8检测试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司。CO2细胞培养箱购自美国Forma Scientifis公司;Light Cycler480 Ⅱ型荧光定量PCR仪购自瑞士Roche公司;倒置显微镜购自日本Olympus公司。

1.1.2 动物来源SPF级雄性Dicer flox转基因豚鼠12只,3周龄,体重140～170 g,购自上海市计划生育科学研究所[SCXK(沪)2018-0002],室温20～25 ℃,湿度50%～60%。小鼠自由进食、进水,每天保持12 h/12 h昼夜循环,光照强度500 lx。豚鼠屈光度+3～+8 D,双眼屈光参差≤1.5 D,无角膜混浊、角膜炎、先天性近视等眼部疾病。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠形觉剥夺性近视模型建立将白色半透明乳胶气球制成豚鼠形觉剥夺头套,固定颈部,用头套遮盖豚鼠左眼(实验眼),右眼未遮盖(对照眼),行单眼形觉剥夺,不压迫眼睑,同时暴露口鼻、双耳,豚鼠正常饮食。造模期间每天检查并清洁头套,保证其透光性。4周后采用红外偏心摄影验光仪测量豚鼠双眼屈光度,测量方法如下:10 g·L-1托吡卡胺滴眼液滴双眼,3 min后瞳孔散大,在合适的工作距离 (0.5 m)内使用带状光检影镜保持三孔一线,并检测屈光度。所有检查均由同一组(两人)技术人员完成,盲法检查。检查期间间断性于大鼠眼表滴生理盐水,防止角膜干燥。每眼测量3次,取平均值,左眼屈光度下降幅度大于4 D则表明左眼造模成功。

1.2.2 检测豚鼠巩膜组织中miR-184及PI3K-Akt信号通路相关mRNA表达颈椎脱臼处死造模成功豚鼠,摘取双侧眼球,显微镜下剥离眼周肌肉组织,除去视网膜、玻璃体、脉络膜,分离获取巩膜,冲洗标本后迅速冻存于液氮中备用。采用Trizol溶液裂解组织并抽提总RNA,将RNA反转录成cDNA,以GAPDH为内参,按照试剂盒说明建立PCR反应体系。PCR反应体系:20 mg·L-1RNA 1.0 μL,100 mmol·L-1dNTP 0.2 μL,10×逆转录缓冲液 1.5 μL,Rnase inhibitor (核糖核酸酶抑制剂)0.2 μL,reverse transcriptase(逆转录酶) 1.0 μL,RT primer (逆转录引物)3.0 μL, H2O 8.1 μL,共15 μL。PCR反应:95 ℃预变性30 s、95 ℃变性5 s、6 ℃退火30 s,70 ℃延伸30 s,共45个循环。采用实时定量PCR进行检测,建立PCR产物熔解曲线,计算Ct值。通过2-△△Ct法计算豚鼠巩膜组织中miR-184与PI3K、Akt、mTOR的mRNA相对表达量,其中△△Ct=(Ct实验组目的基因-Ct实验组GAPDH)-(Ct对照组目的基因-Ct对照组GAPDH)。

1.2.3 细胞培养及分组取生长良好的人巩膜成纤维细胞,用pH 7.4 DMEM培养液(含体积分数10%胎牛血清、1 g·L-1谷氨酰胺)进行培养,置于37 ℃、体积分数5%CO2饱和湿度培养箱中培养,细胞长满培养瓶后弃培养基,加入2.0 mL Hank液,除去残余血清。弃Hank液,加入1.8 mL Hank液以及0.2 mL胰蛋白酶消化细胞3 min,待细胞基本漂浮后将细胞悬液转移至15 mL离心管,1000 r·min-1离心5 min,弃上清液。加入1 mL完全培养基,轻轻吹打细胞3次,使细胞成单混悬液。加入完全培养基,调整细胞密度用于后续实验。实验分组:体外培养人巩膜成纤维细胞,并分为对照组(mimics对照组)、高表达组(转染miR-184 mimic)、低表达组(转染anti-miR-184)和PI-103组(加入PI3K通路抑制剂PI-103),均处理48 h后进行以下各项实验。

1.2.4 Western blot检测各组细胞中PI3K-Akt信号通路相关蛋白表达采用Western blot检测各组细胞中PI3K-Akt信号通路相关蛋白(PI3K、Akt、mTOR)表达。4组细胞培养72 h,设置6个复孔,PBS洗3次,加入细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂)提取总蛋白,将待测蛋白液上样到SDS-PAGE(100 g·L-1)凝胶电泳中,电泳分离后转移至PVDF膜,50 g·L-1脱脂牛奶封闭,取膜,清洗,抗PI3K、Akt、mTOR一抗(稀释比例为1500)4 ℃孵育过夜,加入辣根过氧化物酶标记的二抗,室温孵育1 h后,TBST洗3次,最后滴加ECL发光液曝光显影,检测蛋白质条带,以GAPDH为内参,ImageJ软件分析各条带灰度值,计算各组细胞中PI3K、Akt、mTOR蛋白相对表达量。

1.2.5 CCK-8法检测细胞增殖采用CCK-8法检测各组人巩膜成纤维细胞增殖能力,调整各组细胞密度为1×104个·mL-1,设置6个复孔,接种于96孔板,于37 ℃、体积分数5%CO2饱和湿度培养箱中培养 0 h、24 h、48 h、72 h、96 h,加入CCK-8试剂孵育4 h,于450 nm波长下检测OD值,并计算细胞增殖倍数,细胞增殖倍数=OD时间/OD0 h。

1.2.6 Annexin V-FITC染色检测细胞凋亡采用Annexin V-FITC染色检测细胞凋亡情况。收集4组细胞,设置6个复孔,PBS洗3次,采用1×Binding buffer将待测细胞制成1×106个·mL-1的细胞悬液,于37 ℃、体积分数5%CO2饱和湿度培养箱中培养24 h,加入Annexin V-FITC,避光、室温孵育10 min,碘化丙啶染色液(10 μL)进行染色,15 min后采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2 结果

2.1 豚鼠巩膜组织中miR-184与 PI3K、Akt、mTOR mRNA表达水平豚鼠实验眼巩膜组织中miR-184与PI3K、Akt、mTOR mRNA表达水平均明显低于对照眼,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(表1)。

表1 豚鼠巩膜组织中miR-184与PI3K、Akt、mTOR mRNA表达水平

2.2 豚鼠巩膜组织中miR-184与PI3K、Akt、mTOR mRNA表达水平相关性Pearson相关性分析结果显示,豚鼠实验眼巩膜组织中miR-184与PI3K、Akt、mTOR mRNA表达水平均呈正相关性(r=0.662、0.719、0.676,均为P<0.05)(图1～3)。

图1 豚鼠巩膜组织中miR-184与PI3K mRNA表达水平相关性

图2 豚鼠巩膜组织中miR-184与Akt mRNA表达水平相关性

图3 豚鼠巩膜组织中miR-184与mTOR mRNA表达水平相关性

2.3 人巩膜成纤维细胞增殖情况培养24 h、48 h、72 h、96 h时,高表达组细胞增殖倍数>对照组>低表达组>PI-103组。培养24 h时,4组细胞增殖倍数比较差异无统计学意义(P>0.05)(图4)。培养48 h、72 h、96 h时,4组细胞增殖倍数整体比较及组间两两比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

图4 4组人巩膜成纤维细胞增殖情况

2.4 人巩膜成纤维细胞凋亡情况培养24 h时,对照组、低表达组、高表达组、PI-103组细胞凋亡率分别为(13.2±4.4)%、(25.6±2.1)%、(8.3±1.8)%、(34.8±4.6)%,4组细胞凋亡率比较差异有统计学意义(P<0.05),PI-103组>低表达组>对照组>高表达组,组间两两比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

2.5 人巩膜成纤维细胞中PI3K-Akt信号通路相关蛋白表达水平培养72 h时,4组细胞中PI3K、Akt、mTOR蛋白表达水平差异均有统计学意义(均为P<0.05),高表达组细胞中PI3K、Akt、mTOR蛋白表达水平>对照组>低表达组>PI-103组,组间两两比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图5、表2)。

图5 人巩膜成纤维细胞中PI3K-Akt信号通路相关蛋白表达

表2 人巩膜成纤维细胞中PI3K-Akt信号通路相关蛋白表达水平

3 讨论

近视是临床常见的眼部疾病,也是发病率最高的屈光不正,特别是随着青少年学业的加重以及电子产品使用率的增加,近视发病人群也趋于年轻化。在整体发病率增加的同时,高度近视(屈光度≥6 D)发病率也呈增加趋势,极易导致视网膜脱落、变性以及巩膜葡萄肿等一系列严重并发症,严重影响患者生活质量[7]。巩膜结构变化(巩膜重塑、巩膜细胞外基质代谢异常、后极部巩膜变薄等)是导致近视发生、发展的关键原因[8]。近年来有研究发现,miRNA在眼部发育、眼科疾病中也能发挥重要调控作用[9]。如miR-328与PAX6基因3’-UTR区域特异性结合后下调PAX6基因的表达,进而增加基质金属蛋白酶2的表达,诱导巩膜细胞外基质降解,导致巩膜变薄以及眼轴延长[10];miR-29负性调节眼部胶原蛋白表达,使巩膜变薄,导致近视发生、发展[11]。miR-184低表达与近视的发生、发展存在相关性,miR-184通过调节近视相关基因PAX6的表达以及圆锥角膜而参与近视发生、发展过程[12]。有研究表明[13],圆锥角膜病理过程与细胞信号转导以及细胞代谢异常有关,其中PI3K-Akt信号通路是调控细胞生长、增殖、代谢等生物学过程的重要途径,且Aykutlu等[14]研究已证实miR-184能激活PI3K-Akt信号通路,有利于细胞的多种生物学过程,基于此本研究通过探讨人巩膜成纤维细胞中miR-184表达与PI3K-Akt信号通路以及细胞增殖、凋亡的关系,旨在为明确miR-184调控近视发生、发展的具体机制提供指导。

本研究建立了豚鼠形觉剥夺性近视模型,通过检测豚鼠巩膜组织中miR-184表达与PI3K-Akt信号通路相关mRNA(PI3K、Akt、mTOR)的表达,发现实验眼的miR-184以及PI3K、Akt、mTOR mRNA均处于低表达状态,即miR-184的低表达与近视发生密切关联。同时,Pearson相关分析结果显示,豚鼠实验眼巩膜组织中miR-184与PI3K、Akt、mTOR mRNA表达水平均呈正相关性(均为P<0.05),提示miR-184能调控PI3K-Akt信号通路,豚鼠实验眼巩膜组织中miR-184表达水平较低,导致PI3K-Akt信号通路受阻,故而PI3K、Akt、mTOR mRNA均处于低表达状态。在低表达组人巩膜成纤维细胞中,PI3K-Akt信号通路激活受阻,导致生长、增殖活力下降,且细胞凋亡增加,使得I型胶原合成减少。李晓萌等[15]研究证实I型胶原减少以及胶原纤维直径降低是引起巩膜重塑的重要病理特征,故而导致巩膜变薄,发生近视。同时,本研究通过在人巩膜成纤维细胞中转染miR-184,发现高表达组细胞增殖倍数较高,凋亡率较低,而低表达组细胞增殖、凋亡情况与高表达组相反,表明上调miR-184表达有利于人巩膜成纤维细胞增殖,并下调细胞凋亡。既往研究发现[16],细胞中的PI3K-Akt信号通路处于激活状态(PI3K、Akt、mTOR mRNA以及蛋白高表达),则细胞增殖活力高,凋亡率低,而本研究采用miR-184激活人巩膜成纤维细胞PI3K-Akt信号通路,提高了人巩膜成纤维细胞的增殖活力,进而大量合成、分泌I型胶原,增加巩膜厚度,延缓近视进展。另外,本研究在使用PI-103抑制PI3K-Akt-mTOR通路后,人巩膜成纤维细胞的增殖活力降低,凋亡率增加,说明PI3K-Akt-mTOR通路参与近视进展。You 等[17]研究证实,圆锥角膜中PI3K-Akt信号通路处于低表达状态,其下游靶基因均参与近视及其并发症的病理过程,在大鼠中高表达miR-184可上调PI3K-Akt信号通路,而抑制miR-184后则PI3K-Akt信号通路明显受阻,进一步证实miR-184参与近视的发生、发展。

综上所述,近视的发生、发展与近视眼巩膜组织中miR-184表达下调有关,其作用机制可能为miR-184表达下调导致PI3K-Akt信号通路调控受阻,进而抑制巩膜成纤维细胞增殖以及促进细胞凋亡。