基于Wnt/β-catenin 信号通路探究过表达miR-124 对胃癌前病变模型大鼠的干预效果

罗 文，王伟宁，彭 进，曾 微，姚 思，张嘉怡

长沙市第一医院消化内科，湖南长沙 410000

胃癌前病变是指在慢性萎缩性胃炎、胃息肉、胃溃疡等各种胃病的基础上，胃黏膜上皮发生异常增生性改变，该病的临床症状不具有典型性，同时其发展是一个漫长的癌变过程[1-2]。如果得不到及时诊治，将会在多种因素的共同作用下导致胃癌，故诊断为慢性萎缩性胃炎、胃息肉等相关疾病时，应及时就治，进行相关检查，根除相关危险因素，降低癌变的可能性[3]。Wnt/β-catenin 信号通路的异常激活对胃黏膜组织细胞的裂变、更新及癌变有着重要影响，对其进行抑制可以减轻胃黏膜的破坏，减少炎症发生[4]。miR-124 在胃癌前病变中起着重要作用，可作为胃癌前病变的诊断标志物。基于上述背景，本文研究分析基于Wnt/β-catenin 信号通路过表达miR-124 对胃癌前病变模型大鼠的干预效果，以明确miR-124与胃癌前病变大鼠的关系，为临床上胃癌前病变的治疗或预防提供有效途径。

材料与方法

1 研究动物 选取43 只SPF 级Wistar 大鼠作前瞻性研究，体质量210 ～ 240g，购置于河南中检检测技术有限公司，动物许可证号：SYXK(豫)2018-0006，所有大鼠在室温(22oC ～ 25oC)、相对湿度50%的无病原菌笼子中进行喂养，饮用水、食物均经高温高压杀毒，适应性喂养8 d，本实验操作均参照动物试验伦理要求的相关规定，且经长沙市第一医院伦理委员会批准同意。

2 分组与建模 随机选择10 只大鼠作为对照组，另外33 只大鼠按照王艺臻等[5]胃癌前病变的建立方法构建模型，并灌胃0.02 mol/L MNNG 溶液(5 g/kg)，连续给予24 周，配合饥饱失常法，进行喂养2 d 饱食、后禁食1 d，期间大鼠自由饮水，并加以情绪刺激，对大鼠胃组织进行确认病理切片检查，胃黏膜产生损害，杯状细胞增多，腺体出现减少、萎缩及无规则排列，胃癌前病变即建模成功。建模过程中死亡3 只大鼠，后将剩余30 只大鼠随机分为模型组、miR-124 抑制剂组和miR-124 模拟物组，每组10 只。对照组大鼠同期进行蒸馏水喂养。

miR-124 抑制剂组的大鼠腹腔注射miR-124 inhibitor，miR-124 模拟物组的大鼠注射miR-124 mimic，10 µg/d，1 次/d，对照组、模型组大鼠腹腔注射同剂量0.9%氯化钠注射液，所有大鼠连续注射8 周。对各组大鼠的表征进行观察记录，测量各组大鼠的体质量，记录进食情况。

3 样本收集 收集每组大鼠右侧颈总动脉血5 mL，离心半径5 cm、3 000 r/min 离心10 min，分离取其上层清液，保存于-80℃。每组大鼠腹腔注射10%水合氯醛 0.4 mL/100 g 麻醉后处死，在离贲门及幽门0.5 ～ 1.0 cm 处取出全胃，后沿胃大弯将其进行侧切开，用0.9%氯化钠注射液进行冲洗，取胃黏膜组织，置于液氮内冷冻，保存于-80℃冰箱待检。

4 病理组织学观察 取大鼠胃组织，固定于10%甲醛溶液中，48 h 后取出，并对其进行常规石蜡包埋，制作厚度5 µm 病理切片，进行脱蜡、脱水操作，并采用苏木素-伊红染色试剂盒进行染色，中性树脂将其封片，光学显微镜下观察其胃黏膜的组织病理变化。使用动物胃镜对所有大鼠的胃黏膜组织病变情况进行检查。

5 miR-124 相对表达量检测 取大鼠胃组织，置于液氮中进行研磨，使用Takara 逆转录试剂盒逆转录为cDNA，采用实时荧光定量法对miR-124 表达量进行检测，通过利用Primer 5.0 软件设计引物序列，启动PCR 仪，反应体系：0.4 µL 上下游引物、1 µL cDNA 模板、10 µL SYBGreen，加蒸馏水至20 µL。反应条件：95℃ 3 min、95℃ 15 s、60℃ 40 s，72℃ 10 min，共进行40 个循环，通过2-△△Ct方法计算出miR-124 的表达水平。

6 表皮细胞生长因子(epidermal growth factor，EGF)和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)表达水平检测 取出各组大鼠冷冻胃组织0.5 g，对其冰上溶解25 min，后放入浆器中加入1∶9 的0.9%氯化钠注射液，将其制成组织匀浆，后离心半径5 cm、3000 r/min 离心10 min，分离取其上层清液，采用ELISA 法检测EGF 表达水平，试剂盒购自博辉生物科技(广州)有限公司，货号：EK-R38399；采用免疫组化法检测EGFR 表达水平，试剂盒购自上海圻明生物科技有限公司，货号：IM-01-1083。

7 白细胞介素-6(interleukin- 6，IL-6)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)水平检测 取出各组大鼠冷冻血清，对其进行解冻，通过ELISA 法对IL-6、TNF-α 水平进行检测，采用碳酸盐缓冲液稀释待测液，将其倒入每个孔中，置于4℃下过夜，后弃去，冲洗干净，后向孔中加入1% BSA，37℃温育1 h，后弃去，冲洗干净，稀释抗血清，之后往每孔加入0.1 mL，于37℃下均匀摇晃40 min，后弃去，冲洗干净，使用TMB进行显色处理，后在450 nm 波长下检测OD 值，检测出IL-6、TNF-α 水平。试剂盒分别购自博辉生物科技(广州)有限公司、武汉菲恩生物科技有限公司，货号：EK-R36902、ER1393。

8 Wnt/β-catenin 通路蛋白表达量 采用Western blot 检测大鼠胃组织中的Wnt/β-catenin 蛋白相对表达量，取每组大鼠冷冻胃组织，进行冰上溶解25 min，制作组织匀浆，后取0.1 g 匀浆加入检测试剂提取液，摇晃均匀，以离心半径5 cm、3000 r/min 离心10 min，提取上层清液，使用BCA 试剂盒检测Wnt、β-catenin 蛋白含量，提取等量蛋白质，100℃变性5 min，通过凝胶电泳进行分离，置于4℃下温育过夜，反复冲洗3 次，加入稀释好的二抗，孵育120 min，反复冲洗3 次，定量分析蛋白表达情况。以GAPDH 为内参，重复试验3 次。

9 统计学处理 采用SPSS 19.0 统计软件包进行统计分析处理。计量资料以±表示，多组间比较采用方差齐性检验，两组间比较采用重复测量的方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 大鼠一般情况 对照组大鼠精神状态良好，动作灵敏，体形肥胖，毛色光泽，进食饮水量正常；模拟组大鼠较对照组大鼠精神萎靡不振，体形消瘦，毛色出现枯黄，进食饮水量变少，活动变少且反应迟钝；miR-124 抑制剂组大鼠较对照组、模拟组的大鼠精神更加不济，体形严重消瘦，毛色枯黄严重，进食饮水量较少，活动缓慢；miR-124 模拟物组大鼠较模拟组、miR-124 抑制剂组大鼠精神尚好，体形增加，毛色有光泽，进食饮水量较多，动作相对灵活。

2 大鼠胃病理组织学观察 如图1 所示，对照组大鼠，胃组织结构未产生明显变化，胃黏膜表面平整，排列规则有序；模型组大鼠，胃黏膜萎缩，腺体变少，杯状细胞出现，排列无序；miR-124 抑制剂组大鼠胃黏膜萎缩更加严重，腺体变更少，杯状细胞出现更多；miR-124 模拟物组大鼠腺体变多、杯状细胞减少。

图1 各组大鼠胃病理组织学观察(HE 染色，200×)A：对照组；B：模型组；C：miR-124 抑制剂组；D：miR-124 模拟物组Fig.1 Pathological histological observation of rats' stomach tissues (HE staining, 200×)A: control group; B: model group; C: miR-124 inhibitor group; D: miR-124 simulator group

3 大鼠胃组织miR-124 相对表达量对比 如表1所示，与对照组相比，模型组、miR-124 抑制剂组、miR-124 模拟物组miR-124 相对表达量下降，差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组相比，miR-124 抑制剂组miR-124 表达水平下降，miR-124 模拟物组miR-124 相对表达量升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与miR-124 抑制剂组相比，miR-124 模拟物组miR-124 相对表达量升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1 各组大鼠肾组织miR-124 相对表达量对比Tab. 1 Comparison of miR-124 expression in kidney tissues

4 各组大鼠EGF、EGFR、IL-6、TNF-α 水平对比如表2 所示，与对照组相比，模型组、miR-124抑制剂组、miR-124 模拟物组EGF、EGFR、IL-6、TNF-α 升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组相比，miR-124 抑制剂组EGF、EGFR、IL-6、TNF-α 升高，miR-124 模拟物组EGF、EGFR、IL-6、TNF-α 水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；与miR-124 抑制剂组相比，miR-124 模拟物组EGF、EGFR、IL-6、TNF-α 水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表2 各组大鼠血清标志物水平对比Tab. 2 Comparison of serum biomarkers levels in each group

5 各组大鼠Wnt/β-catenin 通路蛋白表达量对比如表3 所示，与对照组相比，模型组、miR-124 抑制剂组、miR-124 模拟物组胃组织Wnt/βcatenin 表达量升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组相比，miR-155 抑制剂组Wnt、β-catenin表达量升高，miR-124 模拟物组Wnt/β-catenin 表达量降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；与miR-124 抑制剂组相比，miR-124 模拟物组Wnt/βcatenin 表达量降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图2。

表3 各组大鼠Wnt/β-catenin 通路蛋白表达量对比Tab. 3 Comparison of wnt / β -catenin pathway protein expression in rats

图2 Wnt/β-catenin 信号通路蛋白Western blot 图Fig.2 Western blot of Wnt/β -catenin signaling pathway protein

讨 论

胃癌作为全球癌症发病率极高的恶性肿瘤，具有较高的病死率，对人类的生命安全带来了严重威胁，目前对该病的发病原因尚无明确定论，对疾病的预防较困难，故对其病变前的探究对该病的预防具有重要意义[6-7]。胃癌前病变是胃黏膜病变的过程，主要包括肠上皮化生和异型增生，是正常胃黏膜向胃癌转化过程中的一个重要阶段。

miRNA 作为一种单链的小分子，具有时序性、保守性及组织特异性，在核细胞内活跃，可参与包括肿瘤在内的多种疾病的发生发展[8-9]。miR-124 在miRNA 中属于高度保守的小分子，其表达异常可引发靶基因miRNA 无效，促使肿瘤发生。miR-124 可通过下调ROCK1 表达，达到抑制胃癌细胞的迁移，同时参与对肿瘤EMT 的调控。EGF 作为一种肽类物质，对胃黏膜具有修复作用，EGFR 是活跃在间质、上皮、神经源性组织中的蛋白受体，两者结合会对胃酸分泌产生抑制作用，保护胃黏膜[10-12]。本研究发现，EGF、EGFR高表达于胃癌前病变大鼠，上调大鼠miR-124 表达，可降低EGF、EGFR 表达水平，增加大鼠体质量和进食饮水量，使粪便恢复正常，并改善大鼠的胃黏膜组织。相关研究显示，miR-124 可降低胃癌细胞的非停泊依赖性生长能力，将miR-124 mimics 转染MKN-45 细胞，可使细胞克隆小且数量也减少，从而抑制胃癌细胞的分化，且参与细胞增殖的分子调控，下调miR-124 表达，会促进细胞增殖，加速胃癌前病变的发生发展，与本文研究一致[13-15]。这表明过表达miR-124 可减少对胃黏膜的损害，提高肠胃功能，改善临床表征。

TNF-α 作为具有细胞毒性的促炎性细胞因子，参与机体内的免疫应答；IL-6 对细胞的分化和生长具有重要的调节作用，其水平失调可造成疾病的发生，对机体免疫应答、造血功能起着重要作用[16-19]。本研究发现，在胃癌前病变大鼠中IL-6、TNF-α 高表达，过表达miR-124 可降低大鼠体内IL-6、TNF-α 表达水平。相关研究表明，miR-124 可对产生趋化因子的能力进行调节，过表达miR-124 可降低巨噬细胞及其他促炎性细胞因子活性，抑制胃癌前病变的发展，与本文研究一致[20-22]。这表明过表达miR-124 能够有效改善大鼠的炎症反应。

Wnt 信号通路是一种蛋白质网络，在生物进化和癌症中具有重要作用，能帮助人们理解疾病的发生发展机制，给疾病治疗提供靶点[23]。Wnt/β-catenin 信号通路参与了细胞的黏附作用，可激活原癌基因，使其细胞增殖分化，如果这条通路的蛋白发生了变化，就会导致信号出现异常活化，可诱导癌症的发生[24]。Wnt/β-catenin 信号通路的异常激活可促使胃黏膜上皮细胞及固有细胞的增殖分化，从而产生病变。通过对Wnt/βcatenin 信号通路进行抑制，可抑制其胃黏膜细胞的增殖，加快细胞的死亡，改善胃黏膜损害[25]。本文研究发现，过表达miR-124 可对Wnt/β-catenin信号通路产生抑制作用，改善大鼠的胃黏膜损害。

综上所述，过表达miR-124 可抑制胃癌前病变模型大鼠体内的细胞增殖，使胃黏膜损伤得到改善，减少其炎症反应，其作用机制可能与大鼠的Wnt/β-catenin 信号通路被抑制相关。虽然本研究中过表达miR-124 可使胃癌前病变得到改善，其作用机制可能与Wnt/β-catenin 通路相关，但仅为本研究结果，临床并无研究分析其关系，因此本文上述结果还需后续研究进一步验证，为胃癌前病变的研究提供一定参考价值。

作者贡献罗文：总体构思，资金获取，资源提供，撰写初稿；王伟宁：总体构思，资金获取，监督指导，审读及修订；彭进：方法设计，项目管理，资源提供，技术支持；曾微：规范分析，软件处理，可视化处理；姚思、张嘉怡：数据管理，调查研究，有效验证。

利益冲突所有作者声明无利益冲突。

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