数字光处理成型氮化硅陶瓷牙科种植体的制备及其生物安全性的初步评价

邹蓉芳，毕鲁南，黄 阳，冯暄淇，冯 璐，江小霞，李 伶，邓 斌

1 解放军医学院，北京 100853；2 解放军总医院第一医学中心口腔科，北京 100853；3 军事科学院军事医学研究院军事认知与脑科学研究所，北京 100850；4 山东工业陶瓷研究设计院有限公司，山东淄博255000

氮化硅是一种新型生物陶瓷材料，具有良好的生物相容性和机械性能，近年来作为关节植入物在骨科广泛应用[1]，并且逐渐显现出应用于牙科种植体的潜力[2]。大量研究证实，氮化硅具有良好的成骨性[3-4]，能够促进MC3T3-E1、人骨髓间充质干细胞等一系列成骨细胞的增殖、矿化和成骨基因上调的增强[5]，而且对口腔病原体牙龈卟啉单胞菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的抑菌性均优于纯钛和氧化锆[6-7]，有助于种植体的长期稳定并减少种植体周围炎的发生。

传统干压烧结的氮化硅人体植入物需要模具制备及后期切削等环节，工艺繁复冗杂，无法进行个性化定制。对于需要高精度、个性化定制的牙科种植体来说，引进新的成型工艺，如数字光处理成型技术[8-9]，能够解决个性化陶瓷植入物的成型问题[10-11]。数字光处理成型氮化硅陶瓷制备过程中添加了光敏树脂、光引发剂、分散剂等成分，这些成分在经过脱脂烧结后已基本除净[12]，但应用于人体之前，仍需对其生物安全性重新评价。本研究引入数字光处理成型技术制备氮化硅牙科种植体，对其生物安全性进行初步评价，并观察其微观结构特征，评估机械性能，分析数字光处理成型氮化硅是否符合牙科陶瓷应用的基本要求，进一步探讨其作为牙科种植体的应用潜力。

材料与方法

1 主要材料、试剂与仪器 氮化硅(UBE，日本)；氧化铝、氧化钇(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，上海)；光敏树脂单体1，6-己二醇二丙烯酸酷(HDDA)、乙氧化季戊四醇四丙烯酸醋(PPTTA)、环三羟甲基丙烷甲缩醛丙烯酸醋(CTFA)、光引发剂苯基双(2,4,6-三甲基苯甲酰基)氧化膦[德国良制化学(中国)有限公司，上海]；分散剂SOLSPERSE 45000(艾尼韦尔，天津)；数字光处理成型陶瓷打印机(LITHOZ，奥地利)；超声震荡机(洁盟，深圳)；管式炉(纳博热，德国)；马弗炉(纳博热，德国)；气氛压力烧结炉(岛津，日本)；万能力学试验机(岛津，日本)；扫描电镜(蔡司，德国)；X 线衍射仪(布鲁克D8，德国)；L-929小鼠成纤维细胞(军事科学院细胞库)；DMEM 基础培养基(普诺赛，武汉)；胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗、0.25%胰蛋白酶消化液(Biological Industries，以色列)；磷酸盐缓冲液(PBS，赛默飞，美国)，CCK-8 试剂盒 (碧云天，中国)，活/死细胞双染色试剂盒 (亚科因，美国) ；细胞凋亡荧光Hoechst 33342/PI 双染试剂盒(索莱宝，北京)；细胞培养箱(赛默飞，美国)；超速离心机(Thermo，美国)；ELISA 酶标仪 (TECAN，德国)。

2 数字光处理氮化硅试件的制备 使用三维建模软件设计氮化硅试件，3 mm × 4 mm × 40 mm 长方体试条用于力学性能测试，直径5 mm，厚度0.5 mm 的圆片用于生物安全性试验。使用数字光处理陶瓷打印机，曝光强度900 mJ/cm3，切片层厚20 µm，坯体成型后在600℃下对其进行脱脂烧结。以 2℃/min 的升温速率升温至1 670℃，保温2 h 后，以每小时2℃冷却至室温。

3 数字光处理氮化硅微观结构 扫描电镜观察数字光处理氮化硅表征，X 线衍射仪分析数字光处理成型氮化硅的晶相构成。扫描步长0.02°，扫描范围2θ 角为10° ～ 70°。

4 数字光处理成型氮化硅陶瓷机械性能测试(1)密度：采用阿基米德排水法测定试条的实际密度。(2)抗弯强度：使用万能力学试验机对尺寸为3 mm × 4 mm × 40 mm 的试条进行三点弯曲试验。将试条横放在2 个直径5 mm 的支撑圆柱上，直径5 mm 的圆柱以1 mm/min 的速率垂直方向施压于两支撑圆柱的中点直至试条断裂，记录断裂载荷，计算试条三点弯曲强度(σ)，公式为其中P 为断裂载荷(N)，l 为跨距(mm)，ω 为试条宽度4 mm，b 为试条厚度3 mm。每组测试5 根试条取平均值，收集断裂后的试条，对断裂面进行电镜扫描并分析。(3)弹性模量：测量跨距，把试条放在支座正中，使试条与支撑辊轴线垂直。按照所测弯曲强度的70%作为加载的载荷上限，以0.1 mm/min 的位移速率加载，使用应变片，采用应变测量装置测量试条应变，记录加载过程中载荷与应变的变化值，计算试条弹性模量(E)，公式为其中P1、P2分别为试条在线性范围内加载的初、末载荷(N)，L 为试条支座间的距离(mm)，b 为试条宽度4 mm，h 为试条厚度3 mm， ε1、ε2分别为P1、P2对应的试条跨中的应变。每组测试5 根试条取平均值。(4)断裂韧性：首先，在试条的3 mm × 40 mm 面使用切割机预制0.5 mm 深的初始 V 槽，加入3 µm 金刚石抛光膏，使用万能力学试验机引导剃须刀片对初始V 槽进一步切割并抛光，控制V 槽总深度为0.8 ～1.2 mm，测量V 槽深度。其次，使用万能力学试验机对试条进行四点弯曲实验。将宽为3 mm，带有V 槽面朝下放在2 个直径5 mm 的支撑圆柱上，用2 个直径5 mm 的圆柱以0.5 mm/min 的速度施加载荷，直至试条断裂，记录断裂载荷并计算断裂韧度(KIC)。其中P 为断裂载荷，α 为V 槽深度与样本宽度的比值，S1为支撑跨距，S2为加载跨距，ω 为样本宽度(4 mm)，b 为样本厚度(3 mm)， Y 为应力强度形状系数(Y=1.988 7)。每组测试5 根试条取平均值。

5 材料浸提液的制备 抛光后的氮化硅圆片依次用无水乙醇、去离子水、丙酮进行超声清洗，空气中干燥，在121℃、33 MPa 下灭菌30 min，烘箱内烘干。按圆片表面积与浸提液介质 3 cm2/mL的标准加入完全培养基，置于37℃恒温摇床浸提72 h，0.22 µm 滤器过滤除菌。

6 细胞培养 复苏冻存L929 小鼠成纤维细胞，使用含10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素溶液的高葡萄糖DMEM 完全培养基，在95%湿度、5% CO2和37°C 条件下培养，隔日更换培养基。当细胞达80%融合后进行传代，传代2 次。吸取培养液，培养皿内加入4 mL 胰蛋白酶/EDTA 进行消化，1 000 r/min 离心5 min，弃掉上清液，加入10 mL完全培养基，制备细胞密度为(1 ～ 5)×105/mL 细胞悬液，分别用于CCK-8 检测、流式细胞术和活死细胞染色实验。

7 细胞毒性实验 参考国标GB/T 16886.5-2017，传代后的L929 细胞用2.5 g/L 胰蛋白酶消化， 制成密度为1 × 104/mL 的细胞悬液。以每孔100 µL接种于96 孔板中。置于37℃、5% CO2培养箱中预培养1 d，使细胞贴壁。将材料浸提液按100%、75%、 50%、25%的浓度与完全培养基配比， 分别与培养板内原培养液进行等量交换后继续培养；阴性对照为完全培养基， 无细胞孔中加入完全培养基作为空白对照。每组设置6 个副孔，用倒置显微镜观察。继续培养24 h，弃去原培养基，各孔加入200 µL 完全培养基和20 µL CCK-8试剂，置于细胞孵箱1.5 h，ELISA 酶标仪使用450 nm 的紫外光密度测量各组细胞相对存活率，相对存活率=(实验组D 值-空白对照组D 值)÷(阴性组D 值-空白对照组D 值)×100%。

8 细胞活力实验 将L929 细胞接种于24 孔板(2 × 104/孔)，在CO2细胞培养箱中37℃培养，待细胞贴壁24 h 后加入25%、50%、75%、100%的氮化硅浸提液，再孵育24 h，同时建立阴性对照组。PBS 洗涤细胞两次，0.5 mL 染色液(含0.5 µL活细胞染料和0.5 µL 死细胞染料)加入细胞中，37℃下避光孵育30 min。染色后，再用PBS 洗涤两次，去除多余工作溶液。使用ZEISS 软件在荧光显微镜分析活死细胞，进而评估细胞活力。

9 细胞增殖实验 浸提液培养L929 细胞 1 d、4 d 和 7 d 后，收集每个培养皿中的细胞，进行细胞周期分析。首先用PBS 洗涤细胞，4°C 无水乙醇下固定30 min。以850 g 的速度在离心机中离心，弃去上清液。将固定的细胞再次PBS 洗涤，并在37°C 下用 50 µL RNase (100 µg/mL)处理。4°C 黑暗中用200 µL 碘化丙啶溶液(50 µg/mL 的存储液)染色30 min。通过流式细胞术分析染色的细胞核以确定G0/G1、S 和G2/M 期细胞的比例。增殖指数(PI)根据公式1 计算如下：

10 统计学分析 采用 SPSS 22.0 软件。数据以±表示，应用单因素方差分析进行组间比较，P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 数字光处理成型氮化硅微观结构 数字光处理成型氮化硅X 线衍射图谱如图1A 所示，衍射峰与β 相氮化硅的标准PDF 卡片(PDF#33-1160)完全对应。 氮化硅试条表面扫描电镜如图1B 所示，柱状晶呈交错生长的形貌，发育良好，晶粒分布均匀，且晶粒间呈现典型的多孔疏松结构。试条侧面(沿打印方向)的SEM 结果可以观察到层与层之间的间隙，分布均匀。图1B (d)显示断裂方式多为穿晶断裂，有部分晶粒拔出。

图1 数字光处理成型氮化硅微观结构A：数字光处理成型氮化硅X 线衍射图谱；B：数字光处理成型氮化硅扫描电镜镜下观察(a、b：氮化硅表面；c、d：氮化硅侧面)Fig.1 Microstructure of silicon nitride by digital light processingA: XRD spectrum of digital light processing silicon nitride; B: SEM observation of digital light processing silicon nitride (a, b: silicon nitride surface SEM; c, d: silicon nitride side SEM)

2 数字光处理成型氮化硅力学性能 数字光处理成型氮化硅试条表面完整无缺陷、开裂(图2A)。经测试，数字光处理成型氮化硅密度为2.44 g/cm3；力学性能：弯曲强度为243 MPa，断裂韧性为2.6 MPa·m1/2，弹性模量为125 GPa(图2B) 。

图2 数字光处理成型氮化硅试条及力学性能A：数字光处理成型氮化硅试条；B：数字光处理成型氮化硅的抗弯强度、弹性模量、断裂韧性Fig.2 Digital light processing for forming silicon nitride test strips and mechanical propertiesA: Digital light processing for silicon nitride test strip; B: Bending strength, elastic modulus and fracture toughness of silicon nitride formed by digital light processing

3 细胞毒性 使用不同浓度浸提液培养细胞24 h后，显微镜下(图3A)可见实验组与阴性组细胞形态数量相似，呈梭形和长条形，几乎完全贴壁，无细胞离散，且细胞增殖无抑制。CCK-8 结果如图3B 所示，不同浓度浸提液组的吸光度值与阴性对照组无统计学差异(P＞0.05)，浸提液不同浓度组细胞存活率均大于95%，细胞毒性分级为0 级。说明数字光处理氮化硅陶瓷无潜在细胞毒性。

图3 L929 细胞毒性实验结果 A：L929 细胞在不同浓度浸提液作用24 h 后的光镜下观察(100×)；B：CCK-8 检测L929 细胞活力Fig.3 Cytotoxicity testing results to L929 cell A: Microscopic observation of L929 cells treated with different concentrations of extracts for 24 h (100×); B: Cell viability of L929

4 细胞活力 将L929 细胞在各浓度梯度的数字光处理成型氮化硅陶瓷浸提液中培养24 h，然后进行活死细胞荧光检测实验。如图4 所示，活细胞显示为绿色荧光，死细胞显示为红色荧光。阴性对照组检测到极少量死细胞，25% 浓度浸提液组检测到少量死细胞，50%、75%、100%浓度浸提液组几乎没有检测到死细胞。25% 浸提液组的活细胞数量与对照组基本一致，而50%、75%浓度浸提液组活细胞数量有所增加，100%浓度浸提液组活细胞数量显著增加。

图4 L929 细胞活死细胞荧光染色观察。不同浓度浸提液组与空白对照组相比，活死细胞量无显著差异Fig.4 Microscopic observation of live and dead L929 cells by fluorescence staining. There was no significant difference in the amount of live and dead cells between different concentration groups and blank control group

5 细胞增殖 流式结果(图5)表明，100%浓度浸提液培养的细胞与空白对照组的细胞相比，在细胞周期上没有显著差异。在使用流式细胞术监测细胞增殖的1 周中可以看出，L929 细胞在接触氮化硅陶瓷圆片第1 天即开始增殖，第7 天达到顶峰。第1、4、7 天，浸提液组增殖指数分别为52.04%、64.94%、77.52%，对照组分别为56.60%、62.68%、80.20%，差异无统计学意义(P＞0.05)。

图5 流式细胞术检测L929 细胞周期(第1、4、7 天L929 细胞周期图)Fig.5 L929 cell cycle assay by flow cytometry (L929 cell cycle diagram at 1 d, 4 d, 7 d)

讨 论

根据“争夺表面”的原则，生物材料植入物的演变是细菌定植和组织生长之间的竞争[6]。当组织生长充分且快速时，植入物就不容易被细菌定植[13]。此外，我们认为改善植入物的骨整合可以促进局部免疫恢复，同时也有助于预防长期的种植体周围炎[14]。因此，我们主张抗菌生物材料必须具有良好的生物相容性，因为这不仅是生物安全的基础，也是实现长期抗菌的关键。近年研究发现，氮化硅不仅同时具有抗细菌黏附和促进成骨细胞生长的特性[7,15]，而且本身具有高强度，具有成为口腔种植体的发展潜力。

本研究显示，经X 线衍射图谱对比显示，数字光处理成型氮化硅为纯净的β 相氮化硅，不含杂质，没有发生相的改变。这是其良好成骨性的结构表现，也是下步生物学性能实现的必要条件。扫描电镜显示出典型的层间结构，较好长径比的柱状晶和穿晶断裂的现象，说明数字光处理成型氮化硅层间结合良好。且相邻层的柱状晶粒相互延伸生长，相互交错堆叠，进一步提高了层间的结合强度，避免3D 打印氮化硅陶瓷存在的层间结合不良导致的整体性能的下降。通过对其物相分析，说明数字光处理成型氮化硅的可行性，为后续结构复杂的种植体奠定了理论基础。

本研究使用数字光处理技术打印制备的氮化硅陶瓷样品的弹性模量相比临床投入应用的纯钛、钛合金种植体，更接近骨皮质，这有助于减少“应力屏蔽”现象，从而减少种植体使用时的应力集中。同时因数字光处理技术打印的氮化硅陶瓷在排胶过程中去除了大量有机物成分，留下较多气孔，形成了多孔结构，提高了与人体骨组织的结合面积，为成骨细胞的生长提供了良好的附着。在强度上，虽然该配方体系的氮化硅已一定程度上优于早前报道的数字光处理成型氮化硅的弯曲强度[16]，但目前的机械性能不足以应用于临床[17]，后续将继续考虑通过提高氮化硅打印浆料的固相含量[18]，进一步提高其抗弯强度。

传统干压烧结的氮化硅陶瓷生物相容性已被证实[19-20]，但对于数字光处理成型氮化硅陶瓷的生物安全性尚未得到验证。本研究应用小鼠成纤维细胞L929 对数字光处理成型氮化硅陶瓷浸提液的生物安全性进行了初步评价。

体外细胞毒性实验广泛应用于各种医学材料的评价[20]，参考GB/T 16886，本研究选用CCK-8法进行细胞毒性试验，测定L929 细胞在数字光处理氮化硅陶瓷浸提液中的生长、增殖和损伤情况。L929 细胞经过不同浓度浸提液培养24 h 后，细胞形态无变化，正常增殖，说明数字光处理氮化硅陶瓷对L929 细胞无毒性；活细胞和死细胞数量与阴性对照组相比无统计学差异，说明数字光处理氮化硅对细胞活力未造成消极影响。本实验将L929 细胞培养第1、4、7 天测定细胞周期，发现浸提液组增殖指数均持续增长，与对照组无统计学差异(P＞0.05)，说明数字光处理氮化硅对细胞增殖无消极影响，进一步证实了数字光处理成型氮化硅的生物安全性。

综上所述，以上三个细胞实验互相印证，证明数字光处理氮化硅陶瓷具有一定的生物安全性，但本研究局限于细胞水平，后期需体内动物实验进一步验证数字光处理成型氮化硅的生物相容性。其成骨性和抗菌性也需进一步实验证实。

作者贡献邹蓉芳：起草研究方案，进行实验并采集分析数据，撰写论文；毕鲁南：负责部分材料实验并采集分析数据；黄阳、冯暄淇、冯璐：负责部分生物实验；江小霞、李伶、邓斌：提出研究思路，最终版本修订。

利益冲突所有作者声明无利益冲突。

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