成骨前体细胞来源的外泌体对乳腺癌细胞迁移和增殖影响的研究

阳琴娜，元欣欣，杜锐凯，厉建伟，李英贤，千年松

1解放军医学院，北京 100853；2 中国航天员科研训练中心航天医学基础与应用国家重点实验室，北京 100094；3 解放军总医院第八医学中心呼吸与危重症医学部胸部肿瘤科，北京 100039

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率和病死率较高，晚期乳腺癌患者容易发生溶骨性骨转移并伴有多种骨骼损伤性并发症，严重影响患者的身心健康和生存质量，如何抑制乳腺癌骨转移是目前研究热点之一[1]。近年来研究发现外泌体是一种重要的细胞间通讯方式，参与多种生理过程[2]。外泌体是一种直径为30 ～ 200 nm 的双层脂质膜结构囊泡，可携带包括mRNA、miRNA及线粒体DNA(mtDNA)等核酸和蛋白质在内的多种物质，在多种生理、病理过程中发挥着独特作用[3-6]。研究表明，骨微环境中扩散性肿瘤细胞通常会与成骨细胞结合以维系肿瘤细胞存活并形成微转移[7]，然而成骨细胞来源的外泌体对乳腺癌的作用尚不明确。本研究拟从成骨前体细胞MC3T3-E1 来源外泌体对乳腺癌细胞的调控角度出发，探讨其对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响，以期为开发新的乳腺癌治疗方法以及改善乳腺癌骨转移提供理论支持。

材料与方法

1 主要材料、试剂与仪器 α-MEM 培养基，DMEM培养基，胎牛血清(Gibco，美国)；Transwell 细胞小室(NEST，中国)；CCK-8 试剂盒，蛋白裂解液，4%多聚甲醛，结晶紫(碧云天，中国)；BCA蛋白定量试剂盒(Thermo Fisher，美国)；胰酶，Alix 抗体，CD63 抗体， Lamin A/C 抗体(Sigma，美国)；透射电镜(HITACHI，日本)；超速离心机(Beckman，美国)。

2 细胞培养 4T1 和MDA-MB-231 乳腺癌细胞均置于含10%胎牛血清的DMEM 培养基中培养，MC3T3-E1 细胞置于含10%胎牛血清的α-MEM 培养基中培养，以上细胞均培养于37℃、5% CO2的细胞培养箱中。

3 MC3T3-E1 细胞来源外泌体的提取和鉴定 使用含10%去外泌体血清的α-MEM 培养基，连续培养MC3T3-E1 细胞48 h 后，收集细胞培养上清液。上清液400 g 离心5 min 去除死细胞，上清继续通过2 000 g 离心15 min 去除细胞碎片，然后将细胞通过10 kU 超滤管浓缩，4℃下10 000 g 离心30 min，去除凋亡小体后进行超速离心，120 000 g离心70 min，离心后的沉淀重悬于PBS，经0.22 µm滤膜过滤后，用BCA 蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，-80℃冰箱保存备用。Western blot 检测鉴定外泌体表面标志蛋白Alix、CD63，并用ImageJ 软件对条带进行灰度分析确定蛋白的相对表达量。

4 外泌体透射电镜分析和粒度分析 约20 µg 重悬于PBS 的MC3T3-E1 来源的外泌体以2%多聚甲醛在室温下固定30 min，将外泌体滴在石蜡膜上，用镊子将电镜载网的高聚物碳包被一面扣在液滴上，以吸附液体在载网上；用紫外线预处理电镜实验所需的铜网以减少静电，将8 µL 混合物滴到铜网上，干燥30 min；载网滴加2%醋酸双氧铀，孵育15 min，用滤纸吸去多余的液体，晾干；使用HT7700 透射电子显微镜在120 kV 下检查干燥的铜网并拍照。将MC3T3-E1 细胞的培养液用0.22 µm 滤膜过滤，在清华大学使用Malvern LM10 进行Nanosight 分析。

5 CCK-8 检测外泌体对乳腺癌细胞活性的影响实验分组设置为对照组(4T1 和MDA-MB-231 培养于DMEM 培养基中)和实验组(4T1 和MDA-MB-231分别培养于添加20 µg/mL、30 µg/mL、50 µg/mL外泌体的DMEM 培养基中)，取生长状态良好的乳腺癌细胞，使用胰酶消化，离心弃上清后收集细胞，用培养基重悬细胞并计数，将乳腺癌细胞以 2 × 104/孔接种于96 孔板中，每组设计6 个复孔，培养24 h 后，按照CCK-8 试剂盒说明书加入CCK-8 试剂后置于培养箱中孵育静置2 h，使用酶标仪于波长450 nm 处检测每孔的分光光度值。

6 划痕实验检测外泌体对乳腺癌细胞迁移的影响实验分组设置为对照组(4T1 和MDA-MB-231培养于DMEM 培养基中)和实验组(4T1 和MDAMB-231 培养于添加20 µg/mL 外泌体的DMEM 培养基中)，先用标记笔在6 孔板背后比照直尺均匀画横线，每隔1 cm 画一道横线，每孔至少有5 条线穿过，细胞以1 × 105/孔接种于6 孔板中，待细胞铺满后用无菌的100 µL 枪头沿直尺垂直于所画横线划出细胞划痕，枪头竖直无倾斜，每孔约画4 条划痕，用无菌PBS 清洗2 次去除划下的细胞，更换为无血清的培养基，放入37℃ 5% CO2恒温箱中，分别于0 h、24 h 在显微镜下观察并拍照，ImageJ 软件测量划痕面积并计算细胞迁移率。

7 Transwell 实验检测外泌体对乳腺癌细胞迁移的影响 实验分组设置为对照组(4T1 和MDA-MB-231 培养于DMEM 培养基)和实验组(4T1 和MDAMB-231 培养于添加20 µg/mL 外泌体的DMEM 培养基)，将处于对数生长期的细胞，用胰酶消化后，用无血清细胞培养基重悬细胞。在24 孔板的小室下加入750 µL 完全培养基，小室内分别加入150 µL 细胞悬液，37℃ 5% CO2培养箱培养24 h。取出Transwell 小室，弃去上清液，用PBS 小心浸洗2 次，加4%多聚甲醛固定细胞5 mL，30 min后去固定液，加适量结晶紫染色液染30 min，用流水缓慢洗去染色液，用干净的棉球将上室内侧未迁移的细胞擦干净，晾干，显微镜下观察拍照，每个小室随机选取3 个视野，计数迁移的细胞。

8 CCK-8 细胞增殖实验检测外泌体对乳腺癌细胞增殖的影响 实验分组设置为设置为对照组(4T1和MDA-MB-231 培养于DMEM 培养基)和实验组(4T1 和MDA-MB-231 培养于添加20 µg/mL 外泌体的DMEM 培养基)，取生长状态良好的细胞，使用胰酶消化，离心弃上清后收集细胞，用培养基重悬细胞并计数，将细胞以 2 × 103/孔接种于96 孔板中，根据分组加入相应培养液，每组设置3 个复孔，分别在第 1、3、5 天时按照CCK-8 试剂盒说明书方法加入CCK-8 液后置于培养箱中孵育静置2 h，使用酶标仪读取每孔的450 nm 吸光值。

9 细胞克隆形成实验检测外泌体对乳腺癌细胞增殖的影响 实验分组设置为对照组(4T1 和MDAMB-231 培养于DMEM 培养基中)和实验组(4T1和MDA-MB-231 培养于添加20 µg/mL 外泌体的DMEM 培养基中)，取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM 培养液中备用。将细胞以1 500/孔接种于6 孔板中，轻轻转动，使细胞分散均匀，置37℃ 5% CO2细胞培养箱中培养1 周，终止培养并弃去上清液，用PBS小心浸洗3 次。加4%多聚甲醛固定细胞6 mL，30 min 后去固定液，加适量结晶紫染色液染30 min，用流水缓慢洗去染色液，待干燥，显微镜(200×)计数大于10 个细胞的克隆数。

10 统计学分析 采用GraphPad Prism 软件进行统计分析，计量资料实验数据以±表示，两组实验数据结果比较采用t检验，多组之间差异采用方差分析，两两比较采用Dunnett-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 MC3T3-E1 细胞来源的外泌体提取及鉴定 通过超速离心法提取MC3T3-E1 细胞培养上清中的外泌体，在透射电子显微镜下可见圆形或椭圆形的囊泡状结构小体(图1A)。纳米颗粒跟踪分析(nanopartic tracking analysis，NTA)显示MC3T3-E1 细胞来源的外泌体直径分布为100 ～ 200 nm(图1B)。对细胞培养上清中囊泡蛋白进行Western blot 检测，Western blot 检测到外泌体标志性蛋白Alix、CD63 表达阳性，核蛋白质Lamin A/C 表达阴性(图1C)，用ImageJ 软件对Western blot 条带进行灰度值分析，外泌体中Alix 的相对表达量为0.6，TSG 101 的相对表达量为0.5，细胞中Lamin A/C 的相对表达量为1.2，Actin 相对表达量为0.5(图1D)，以上结果表明成功提取MC3T3-E1 细胞来源的外泌体。

图1 外泌体纯度鉴定A： 透射电子显微镜下结果；B：纳米颗粒跟踪分析结果；C：外泌体相关蛋白鉴定；D：外泌体相关蛋白灰度分析Fig.1 Identification of exosomesA: TEM image; B:NTA results; C: Identification of exosomes related proteins; D: Gray level analysis of exosomes related proteins

2 MC3T3-E1 细胞来源的外泌体对乳腺癌细胞活性的影响 CCK-8 实验检测MC3T3-E1 细胞来源的外泌体对乳腺癌4T1 和MDA-MB-231 细胞活性的影响，用浓度为20 µg/mL、30 µg/mL、50 µg/mL的MC3T3-E1 细胞来源外泌体与乳腺癌细胞共培养24 h 后，CCK-8 结果显示，4T1 对照组的OD值为3.872 ± 0.008 ，与20 µg/mL 外泌体共培养后的4T1 细胞OD 值为3.842 ± 0.013，与对照组OD值比较无统计学差异(P＞0.05)，说明20 µg/mL 外泌体不影响4T1 癌细胞活性；与30 µg/mL 外泌体共培养后的4T1 癌细胞OD 值为3.747 ± 0.009，与50 µg/mL 外泌体共培养后的4T1 癌细胞平均OD值为3.667 ± 0.023，与对照组OD 值比较均有统计学差异(P均＜0.01)，说明30 µg/mL 和50 µg/mL外泌体均能降低4T1 癌细胞的活性(图2A)。MDAMB-231 对照组的平均OD 值为3.722 ± 0.020，与20 µg/mL 外泌体共培养后的MDA-MB-231 细胞平均OD 值为3.720 ± 0.019，与对照组OD 值比较无统计学差异(P＞0.05)，说明20 µg/mL 外泌体不影响MDA-MB-231 癌细胞的活性；与30 µg/mL 外泌体共培养后的MDA-MB-231 癌细胞OD 值为3.631 ±0.016，与50 µg/mL 外泌体共培养后的MDA-MB-231 癌细胞OD 值为3.517 ± 0.015，与对照组OD 值比较有统计学差异(P均＜0.01)，说明30 µg/mL 和50 µg/mL 外泌体均能降低MDAMB-231 癌细胞的活性(图2B)，根据以上结果得出结论，30 µg/mL、50 µg/mL 外泌体能降低乳腺癌细胞的活性，20 µg/mL 外泌体不影响乳腺癌细胞的活性，因此选用20 µg/mL 外泌体进行后续功能实验。

图2 MC3T3-E1 细胞来源外泌体对乳腺癌细胞活性的影响A：4T1 细胞CCK-8 活性实验定量结果；B：MDA-MB-231 细胞CCK-8 活性实验定量结果Fig.2 MC3T3-E1 derived exosomes on the viability of breast cancer cellsA: Quantitative results of CCK-8 activity assay in 4T1 cells; B: Quantitative results of CCK-8 activity assay in MDA-MB-231 cells

3 MC3T3-E1 细胞来源的外泌体促进乳腺癌细胞迁移 通过划痕实验和Transwell 实验检测MC3T3-E1 细胞来源外泌体对乳腺癌4T1 和MDA-MB-231细胞增殖的影响，实验分组设置为对照组(4T1 和MDA-MB-231 培养于DMEM 完全培养基)和实验组(4T1 和MDA-MB-231 培养于添加浓度为20 µg/mL的MC3T3-E1 细胞来源外泌体的DMEM 完全培养基)，划痕实验结果显示，外泌体可以促进细胞向中间空白领域迁移，4T1 对照组迁移率为65.1% ±4.8%，实验组的迁移率为73.3% ± 5.1%，实验组的迁移率高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)，MDA-MB-231 对照组的迁移率为60.2% ±8.3%，实验组的迁移率为75.8% ± 7.0%，实验组的迁移率高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)，见图3A；Transwell 实验结果显示，4T1 对照组的迁移数目为150 ± 7，实验组的迁移数目为394 ± 19，实验组的迁移数目高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)，MDA-MB-231 对照组的迁移数目为147 ± 16，实验组的迁移数目为433 ±43，实验组的迁移数目高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)，见图3B。

图3 MC3T3-E1 细胞来源外泌体对乳腺癌细胞迁移能力的影响(200×)A：划痕实验镜下观察和定量结果；B：Transwell 实验镜下观察和定量结果Fig.3 MC3T3-E1 derived exosomes on the migration of breast cancer cells (200×)A: Observation under the microscope of the scratch test and quantitative results of the scratch test; B: Observation under the microscope of the transwell test and quantitative results of the transwell test

4 MC3T3-E1 细胞来源外泌体促进乳腺癌细胞的增殖 通过CCK-8 实验和克隆形成实验检测MC3T3-E1 细胞外泌体对乳腺癌4T1 和MDA-MB-231 细胞增殖的影响，CCK-8 结果显示，5 d 时，4T1 对照组的OD 值为2.285 ± 0.350，实验组的OD 值为2.944 ± 0.384，实验组与对照组的克隆形成数有统计学差异(P＜0.01)，MDA-MB-231 对照组的OD 值为2.249 ± 0.362，实验组的OD 值为2.934 ± 0.379，实验组与对照组的OD 值有统计学差异(P＜0.01)，提示MC3T3-E1 细胞外泌体对乳腺癌4T1 和MDA-MB-231 细胞增殖有显著促进作用(图4A)。通过克隆形成实验检测MC3T3-E1 细胞外泌体对乳腺癌4T1 和MDA-MB-231 细胞增殖情况的影响，结果显示4T1 对照组的克隆形成数目为17 ± 2 个，实验组的克隆形成数目为32 ±2 个，实验组与对照组的克隆形成数有统计学差异(P＜0.01)，MDA-MB-231 对照组的克隆形成数目为11 ± 1 个，实验组的克隆形成数目为16 ±1 个，实验组与对照组的克隆形成数有统计学差异(P＜0.05)，提示MC3T3-E1 细胞外泌体对乳腺癌4T1 和MDA-MB-231 细胞克隆形成也有显著促进作用(图4B)。

图4 MC3T3-E1 细胞来源外泌体对乳腺癌细胞增殖能力的影响A：CCK-8 增殖实验定量结果；B：克隆形成实验和定量结果Fig.4 Effecf on MC3T3-E1 derived exosomes on the proliferation of breast cancer cellsA: Quantitative results of CCK-8 proliferation experiment; B: Colony formation assay and quantitative results

讨 论

骨是主要由成骨细胞和破骨细胞介导的代谢极其活跃的组织，成骨细胞能促进肿瘤细胞在骨微环境中的定植和生长[8]。现已有多项研究表明成骨细胞在促进肿瘤细胞的骨内增殖和骨转移方面起着关键作用[9-10]。成骨细胞能够分泌一些细胞因子来促进肿瘤细胞的骨转移[11]。同时也有报道显示，骨微环境中的外泌体可介导基质细胞与癌细胞之间的互相作用，从而介导肿瘤细胞在骨中的存活、定植和转移[12-17]，但成骨细胞来源的外泌体对肿瘤细胞影响的研究还很缺乏，成骨细胞来源的外泌体对肿瘤细胞是否有促增殖迁移作用目前也没有明确研究。因此，本研究以成骨前体细胞和乳腺癌为切入点，探讨成骨前体细胞来源的外泌体对乳腺癌骨转移的影响，旨在为乳腺癌骨转移领域的进一步研究提供依据。

研究表明，外泌体是一种直径30 ～ 200 nm 的双层脂质膜结构囊泡，外泌体鉴定分析主要是从三方面进行分析：(1)透射电子显微镜分析外泌体的形貌；(2)纳米粒子示踪分析统计外泌体的粒径分布情况；(3)蛋白质印迹分析外泌体所携带的蛋白标志物[18]。本研究提取的MC3T3-E1 来源外泌体透射电镜观察下为脂质双分子层形成的囊泡结构，粒径检测显示外泌体直径分布在100 ～ 200 nm，Western blot 结果显示外泌体中有Alix 和TSG101外泌体标志蛋白的表达，不表达核蛋白质Lamin A/C，符合外泌体的特征及鉴定标准。

为了确定功能试验使用的适宜外泌体浓度，本研究将MC3T3-E1 来源的外泌体设置为不同浓度梯度(20 µg/mL、30 µg/mL、50 µg/mL)并分别与乳腺癌细胞4T1 和MDA-MB-231 共培养，检测外泌体对乳腺癌细胞活性的影响，同时设定不加外泌体的乳腺癌细胞对照组，在培养24 h 后，采用CCK-8 法对乳腺癌细胞的活性进行检测，发现相比对照组，20 µg/mL 的MC3T3-E1 来源外泌体对乳腺癌细胞的活性没有影响，同时30 µg/mL、50 µg/mL 外泌体能降低乳腺癌细胞的活性。短时间的外泌体处理对乳腺癌细胞活性产生抑制作用，可能是由于大量外源物质随外泌体进入乳腺癌细胞中，对细胞内正常生物学过程有较大影响，同时高浓度外泌体通过质膜融合方式进入细胞可能会影响细胞膜稳定性，并非正常生理条件下外泌体对乳腺癌细胞的作用，但以上推测需进一步实验验证，后续功能试验选择无活性抑制的20 µg/mL 浓度外泌体进行。

本研究将MC3T3-E1 来源的外泌体与乳腺癌细胞共培养进行划痕实验和Transwell 实验，发现成骨细胞前体细胞MC3T3-E1 来源外泌体能够促进乳腺癌细胞的迁移。同时本研究通过CCK-8 增殖实验和克隆形成实验，发现MC3T3-E1 来源外泌体能够促进乳腺癌细胞的增殖，外泌体的促增殖作用已经在很多研究中得到证实[19-22]，外泌体促肿瘤细胞迁移及在骨组织中早期定植的作用已经在一些研究中得到证实，研究表明来自间充质干细胞释放的脂肪细胞来源外泌体通过Hippo 信号通路促进了乳腺癌细胞的增殖和迁移[23]。也有研究表明乳腺癌分泌的外泌体通过促进破骨细胞的分化来建立骨组织中预转移微环境进而促进乳腺癌的迁移和定植[24]。肿瘤细胞来源的外泌体通过诱导脂肪细胞中的米色/棕色分化和代谢重编促进肿瘤的进展[25]。本研究在此基础上证明成骨细胞前体细胞的外泌体有促进乳腺癌细胞迁移和增殖的作用，但具体分子机制尚需进一步实验验证。

有研究表明，p38-MAPK、NF-κB、RAS/ERK等信号通路对肿瘤的发生发展和预后有一定的影响[26-34]，其中p38-MAPK 信号转导通路存在于大多数真核细胞内，通过参与调控细胞的一系列生理活动发挥功能，p38-MAPK 信号转导通路磷酸化后可调节细胞生长和增殖，抑制p38-MAPK 通路可抑制乳腺癌细胞的增殖和转移[35]。miRNA 作为外泌体内含物的重要组成部分，能够调节肿瘤的发生和发展[36-39]。有研究显示，成骨细胞来源外泌体内高峰度携带miR-21[40]，miR-21 可通过上调p38 信号通路促进乳腺癌的增殖和迁移能力[41]。此前也有研究表明，外泌体介导的促增殖迁移作用可通过Hippo 信号通路或通过诱导靶细胞调控自身DNA 合成和细胞周期活动，进而实现促进靶细胞增殖迁移的作用[42-45]。推测成骨细胞前体细胞来源的外泌体可能通过p38-MAPK 信号通路、Hippo 信号通路或诱导靶细胞调控自身DNA 合成和细胞周期活动来促进乳腺癌细胞的增殖，后续将通过一系列功能试验验证是否是成骨细胞前体细胞来源外泌体中的miR-21 通过Hippo 信号通路或p38-MAPK 信号通路促进乳腺癌的迁移和增殖。

综上所述，本研究在体外验证了MC3T3-E1来源的外泌体可以促进乳腺癌的迁移和增殖，但相关机制仍需深入探讨，探究这些机制可能为开发新的乳腺癌治疗方法以及改善乳腺癌骨转移提供理论支持。本实验仅局限于体外水平，后期将进一步通过体内动物实验验证MC3T3-E1 来源外泌体在乳腺癌中发挥的具体作用。

作者贡献阳琴娜：进行实验，撰写论文；千年松、李英贤：指导实验思路；元欣欣、杜锐凯、厉建伟：指导实验设计。

利益冲突所有作者声明无利益冲突。

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