冷诱导RNA 结合蛋白在大鼠低体温性急性肺损伤中的表达变化

徐耀迪，王佳新，陈旭昕，张春阳，王 凡，丁毅伟，彭 聪，肖 漓，韩志海,1

1 华南理工大学医学院，广东广州 510006；2 解放军总医院第六医学中心呼吸与危重症医学科，北京100048；3 解放军总医院研究生院，北京 100853；4 解放军总医院第八医学中心呼吸与危重医学部研究所，北京市器官移植与免疫调节重点实验室，北京 100091

我国海域辽阔，海洋贸易、海上作业等海上活动日渐增多，海难也时有发生。遇难者在低温海水中浸泡时间过长会发生海水浸泡性体温过低症。根据人体核心体温将体温过低分为三类：轻度 (32°C ～ 35°C)、中度 (28°C ～ 32°C) 和重度(＜28°C)[1-2]。肺是体温过低症损伤的主要靶器官之一，既往有许多临床案例报道重度低体温症患者会出现明显呼吸抑制，并伴有肺炎、肺水肿甚至肺损伤等并发症，病情严重会造成患者死亡[3-4]。低体温性急性肺损伤(acute lung injury，ALI)病情严重且复杂，发生机制不明，研究低体温性ALI的致伤机制可以为临床救治提供参考。本课题组前期研究发现低温海水长时程浸泡后大鼠肺部出现明显的损伤，以肺水肿、肺泡及间质炎性细胞浸润为主，部分血管内见血栓形成[5]。很多研究发现ALI 进展与多种基因和蛋白分子的表达水平相关。有研究报道体温降低时冷诱导RNA 结合蛋白(cold-inducible RNA-binding protein，CIRP)表达增加[6-7]。CIRP 是一种低温诱导蛋白，细胞内CIRP(intracellular cold-inducible RNA-binding protein，iCIRP)维持全身细胞内mRNA 的稳定性并调节着机体低体温下的生命活动，其表达异常与炎症因子的分泌密切相关，并呈温度和时间依赖性[8-9]。当CIRP 从胞内释放变成细胞外CIRP (extracellular cold-inducible RNA-binding protein，eCIRP)，就成为了一种损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)，可以独立促进炎症反应[10-12]，既往研究发现巨噬细胞释放的eCIRP在脓毒症ALI、失血性休克ALI、急性胰腺炎相关ALI 和放射性ALI 中发挥着重要作用[13-18]，但在低体温性ALI 中尚无研究。本研究通过观察分析细胞内和细胞外CIRP 水平变化，为低体温性ALI 的诊治提供实验依据，以期最终提高患者的存活率。

材料与方法

1 主要材料和试剂 大鼠白细胞介素(interleukin，IL)-6、 IL-1β ELISA 试剂盒购于深圳欣博盛生物科技有限公司、大鼠CIRP ELISA 试剂盒购于武汉优尔生生物有限公司、人工海盐购于广州益而生物工程有限公司，苏木素、伊红购于广州维格斯生物科技有限公司，二甲苯购于天津凯信化学工业有限公司，兔抗鼠 CIRP 单克隆抗体购于英国Abcam 公司，山羊血清封闭液、DAB 显色液购于北京中杉金桥生物技术有限公司，原位末端转移酶标记法(TUNEL)试剂盒购于武汉赛维尔生物科技有限公司。

2 实验动物 健康清洁SPF 级8 周龄雄性SD 大鼠，体质量330 ～ 380 g，共40 只，购于北京维通利华实验动物有限公司，许可证编号：SCXK(京)2021-0006。动物实验相关方案通过解放军总医院动物伦理委员会批准(受理编号：SQ2022494)。

3 动物实验分组及造模 8 周龄雄性SD 大鼠，随机分为5 组：0 h 组(0 h)、12 h 低温组、16 h 低温组、20 h 低温组、24 h 低温组，每组8 只。0 h 组与实验组在相同条件下饲养，室温为20℃ ～22℃，保证正常的昼夜节律。本研究改进了课题组的长时程海水浸泡体温过低症大鼠模型。通过前期预实验比较不同温度下大鼠存活率和肺损伤情况，得出18℃为适宜的造模温度。用自来水将人工海盐配成3%的人工海水，在保温箱中加18℃的人工海水，将实验组大鼠固定于特制鼠笼内，再置于人工海水中浸泡，水位与大鼠胸骨平齐，保持头部露出水面，以确保大鼠不会误吸人工海水。在保温箱中连上水泵和制冷压缩机，以保持水温相对恒定。根据分组将大鼠分别浸泡12 h、16 h、20 h、24 h，浸泡1 次后造模结束，造模过程中密切观察大鼠活动状态。造模结束后，取存活大鼠的血液和肺组织。血液凝固后离心取上清液，和肺组织一起置于-80℃冰箱保存。0 h 组不做任何处理，直接取材并保存。

4 大鼠肺系数测定 造模前称大鼠体质量并记录，造模后取大鼠双肺组织，在PBS 液中洗去肺组织表面血渍，用滤纸擦干后称大鼠总肺组织重量。计算各组大鼠肺系数，肺系数=肺湿重(mg)/大鼠体质量(g)。

5 ELISA 检测大鼠血清中IL-1β、IL-6 和eCIRP 的含量 eCIRP 的检测：按说明书稀释蛋白标准品后，在96 孔板中加入不同浓度标准品，待检测样品各100 µL，设置2 个复孔，37℃避光孵育1 h，弃掉孔板内液体后每孔加入工作液A 液100 µL，37℃避光孵育1 h，用配套洗涤液洗板5 次，每孔再加入工作液B 液，37℃避光孵育30 min，洗板，每孔再加入90 µL TMB 底物溶液，37℃避光显色15 min，后加入50 µL 反应终止液，在酶标仪下测450 nm 吸光度值，并与标准曲线对比，计算出对应浓度。血清IL-1β 和IL-6 的检测：96 孔板加入标准品和待测样品100 µL，各设置2 个复孔，37℃避光孵育90 min，洗板后加入生物素化抗体工作液，37℃避光孵育60 min，洗板后加入酶结合工作物，37℃避光孵育30 min，加TMB孵育后终止反应，测450 nm 吸光度值，计算出对应浓度。

6 PCR 检测大鼠肺组织中CIRPmRNA 的表达水平 称取大鼠肺组织50 mg，先用Trizol 法提取每只大鼠总RNA，检测RNA 的纯度和浓度，将浓度过高的RNA 进行适当稀释，使终浓度为100 ～500 ng/µL。按照说明书逆转录合成cDNA，并按照试剂盒配置反应体系及设置上机程序进行PCR扩增，以磷酸甘油醛脱氢酶(GADPH)作为内参，测出Ct 值，用2-ΔΔCt计算目的基因CIRP mRNA 表达水平。CIRP 引物上游：GGTGGTGGTAAAGGA CAGG ，下游：CCATCCACAGACTTCCCATTC。GADPH 引物上游：CTGGAGAAACCTGCCAAGT ATG，下游：GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT。

7 HE 染色观察各组大鼠肺组织损伤情况 将固定于4%多聚甲醛中的肺组织制成石蜡切片。将石蜡切片放入二甲苯脱蜡，再用乙醇洗去二甲苯，流水冲洗后用苏木素染色3 min，冲洗后依次经过分化、返蓝处理，再用伊红染色30 s，依次经过85%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、二甲苯浸泡，中性树胶封片。普通光学显微镜下观察染色结果，并根据美国胸科协会ALI 的病理评分对切片进行肺损伤评分[19]。

8 TUNEL 染色观察大鼠肺组织凋亡情况 肺组织切片脱蜡冲洗后，滴加蛋白酶工作液，37℃孵育20 min，PBS 冲洗后加入TUNEL 溶液，37℃孵育1 h，再次PBS 冲洗后滴加TUNEL 溶液室温孵育20 min，PBS 洗涤后进行DAB 染色，然后用苏木素复染，再经过不同浓度梯度乙醇脱水、透明、封片，于荧光显微镜下观察。以阳性细胞比例分析并比较各组间大鼠肺组织的差异，阳性细胞比例=阳性细胞数/细胞总数[20]。

9 免疫组化染色观察iCIRP 在大鼠肺组织的定位及表达 石蜡切片烤片脱蜡复水，然后用含EDTA的柠檬酸抗原修复液修复20 min，再依次经过3%H2O2室温孵育、封闭液室温封闭1 h、4℃一抗孵育过夜、二抗室温孵育30 min，最后DAB 室温孵育2 ～ 5 min，显微镜下观察，出现棕色颗粒后蒸馏水冲洗3 次，然后用苏木素染核3 min，PBS清洗后蒸馏水泡5 min，再进行脱水、透明、封片，操作同前，光学显微镜下观察。用ImageJ 软件分析结果。

10 图像处理及统计学方法 图像采用ImageJ 软件分析，数据采用SPSS 25.0 统计软件分析，并使用GraphPad 8.0.2 对数据进行可视化处理，服从正态分布的计量资料以±表示，行单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 低体温肺损伤模型中肺组织病理形态的变化相较于0 h 组，16 h 组(P＜0.05)、20 h 组(P＜0.01)和24 h 组(P＜0.01)大鼠肺系数增加，差异有统计学意义。HE 染色观察，0 h 组的大鼠肺组织病理结构相对正常，肺泡结构完整，无充血水肿，无炎症细胞浸润。12 h 组广泛可见肺泡壁有弥散的淋巴细胞和中性粒细胞浸润，少见肺泡壁轻度增厚；16 h 组可见较多肺泡壁增厚，伴有少量的淋巴细胞与中性粒细胞浸润；局部肺泡腔与支气管管腔内可见出血；20 h 组多见肺泡壁增厚，伴有淋巴细胞与少量中性粒细胞浸润，局部可见轻度出血，多处支气管管腔内可见嗜酸性黏液分泌，局部可见脱落的上皮细胞；24 h 组可见较大量的肺泡壁增厚，部分肺泡壁破坏，伴有中度的淋巴细胞和中性粒细胞浸润；少见支气管管腔内有嗜酸性黏液分泌。对各组HE 染色评分，发现与0 h 组相比，20 h 组(P＜0.05)和24 h 组(P＜0.01)大鼠肺损伤评分显著增加，差异均有统计学意义。见图1、图2。

图1 各组大鼠肺组织病理表现Fig.1 Pathological manifestations of lung tissues of rats in each group

图2 各组大鼠肺组织损伤评分和肺系数比较Fig.2 Comparison in rat lung tissue damage score and lung coefficient between different groups

2 大鼠肺组织凋亡情况的变化 在荧光显微镜下观察TUNEL 染色情况，发现与0 h 组相比，各实验组凋亡细胞比例均有所增加(P＜0.01)，差异均有统计学意义。见图3、图4。

图3 各组大鼠肺组织凋亡情况比较Fig.3 Apoptosis of lung tissue of rats

图4 各组大鼠肺组织凋亡阳性率比较Fig.4 Comparison in positive rate of apoptosis in lung tissue of rats

3 肺组织中炎症因子IL-6、IL-1β 和eCIRP 的表达 ELISA 结果显示，与0 h 组相比，12 h 组和16 h 组的IL-6、IL-1β 无统计学差异，20 h 组和24 h 组的IL-6 表达水平显著升高(P＜0.01)； 16 h组(P＜0.05)、20 h 组(P＜0.01)和24 h 组(P＜0.01)IL-1β 增加；12 h 组(P＜0.05)、16 h 组(P＜0.05)、20 h 组(P＜0.05)和24 h 组(P＜0.01) eCIRP 表达升高，差异有统计学意义。相关性分析发现，血清中eCIRP 表达与IL-6 表达呈正相关(r=0.748，P＜0.01)；与IL-1β 表达同样呈正相关(r=0.770，P＜0.01)。结果提示，在低体温性ALI 中，eCIRP表达与ALI 严重程度有关，eCIRP 的表达越高，IL-6、IL-1β 表达就越高，炎症程度更严重，这提示血清中eCIRP 可作为一种预测ALI 严重程度的标志物。见图5、图6。

图5 血清中IL-6 (A)、IL-1β (B)、eCIRP (C)的浓度Fig.5 Concentration of IL-6 (A), IL-1β (B) and eCIRP (C) in serum

图6 eCIRP 和IL-6、IL-1β 的相关性分析Fig.6 Correlation of eCIRP with IL-6 and IL-1β

4 肺组织中 CIRP mRNA 的表达 我们用qRTPCR 检测各组大鼠肺组织中CIRP mRNA 表达，结果显示，与0 h 组相比，12 h 组CIRP mRNA 水平变化不显著，16 h 组(P＜0.05)、20 h 组(P＜0.05)和24 h 组(P＜0.01) CIRP mRNA 水平升高，差异有统计学意义，这提示大鼠在低温海水里浸泡16 h后，体内CIRP mRNA 表达开始升高。见图7。

图7 肺组织中CIRP mRNA 的表达Fig.7 Expression levels of CIRP mRNA in lung tissue

5 各组大鼠肺组织中iCIRP 定位及蛋白表达情况免疫组化染色中棕黄色颗粒表示iCIRP 阳性，结果显示，大鼠肺组织中均有棕黄色颗粒沉积，低温刺激后，棕黄色颗粒表达升高，提示iCIRP蛋白表达水平显著升高。用H-Score 来评价iCIRP的表达情况，H-Score=∑(pi × i)=(percentage of weak intensity × 1) + (percentage of moderate intensity × 2) +(percentage of strong intensity × 3)[21]，相比0 h 组，24 h 低温组(t=-5.269，P＜0.01) iCIRP 的表达显著升高。 见图8。

图8 大鼠肺组织中iCIRP 的表达(免疫组化，200×)Fig.8 Expression level of iCIRP in rat lung tissue (IHC, 200×)

讨 论

本研究成功建立了低体温性ALI 大鼠模型，改良了前期课题组的长时程海水浸泡体温过低症大鼠模型，通过增加控温装置和水循环装置，保证海水流动和温度相对恒定，更接近模拟海上遇难者环境。低温海水浸泡的温度和时间是建立低体温性ALI 大鼠模型的关键，温度和时间直接导致大鼠的生理状态、各系统功能和肺损伤严重程度差异。因此，我们通过前期预实验结果最终选择18℃为最适合的造模温度，再进一步探讨低温海水浸泡不同时间肺损伤严重程度及其可能机制。

本研究按照浸泡12 h、16 h、20 h、24 h 这4 个时间点构建SD 大鼠低体温性ALI 模型，观察肺组织病理结构改变以及血清中IL-6、IL-1β 水平。光镜下见低温海水浸泡后的大鼠肺组织出现炎性细胞浸润、肺泡结构破坏、肺泡间隔增厚、肺出血、肺水肿等表现。细胞因子是机体内具有重要生物活性的小分子蛋白质。其中IL-1β 是一种内源性热源质，可促进肝细胞合成急性期蛋白，IL-1β 与炎症、自身免疫性疾病、感染等密切相关。IL-6 通过自分泌和旁分泌形式在局部发挥作用，刺激B 细胞和T 细胞，加速肝细胞急性期蛋白合成，二者共同参与信息传递，在免疫应答、组织修复和炎症反应。本实验中以IL-6 和IL-1β作为炎症程度的指标，结果显示，低温组大鼠血清中IL-6、IL-1β 水平显著升高，伴随低温浸泡时间增加。既往在LPS、盲肠结扎穿孔等众多ALI 动物模型中发现细胞凋亡是导致ALI 的病理因素之一，并证实细胞凋亡与肺损伤严重程度呈正相关[22]。本研究亦发现在低体温性ALI 中大鼠肺组织中细胞凋亡不同程度增加，与本课题组以往研究基本一致，证明了低体温性ALI 造模成功，并提示细胞凋亡与低体温性ALI 发生有关。通过比较不同时间点实验组大鼠状态及肺损伤程度，发现浸泡24 h 时大鼠呼吸微弱，意识状态模糊，对外界刺激无明显反应，出现肺损伤且病死率较低，是较为理想的实验模型。

以往有研究报道iCIRP 在低温刺激下表达升高[23-24]，低温条件下iCIRP 介导炎症因子以mRNA的形式储存于细胞质中，并可诱导其mRNA 翻译，加快炎症因子的产生[25]。而较多研究表明eCIRP 作为一种新发现的DAMP，可以通过TLR4/NF-κB/ICAM1、TLR4/MyD88/STING、TLR4/NF-κB/NLRP3、TREM-1 等通路在不同原因引起的肺损伤发病机制中发挥促炎等作用[13-17,26-27]，但CIRP 在低体温性ALI 中未见报道，我们拟对CIRP 在肺和外周血中的表达情况进行初步研究和讨论。

为了探究CIRP 与低体温性ALI 的相关性，本研究先是构建大鼠低体温性ALI 的动物模型，大鼠肺系数和肺病理损伤评分显示，低温海水浸泡时间越长，造成的肺损伤越严重。相比0 h 组，各实验组细胞凋亡程度显著增加，且与低温海水浸泡时间呈正相关。因此我们推测低温会导致大鼠肺组损伤，且随时间延长，其损伤程度加重。与0 h 组相比，各实验组大鼠血清中的eCIRP水平也随低温浸泡时间增加而升高，表明血清eCIRP 与低体温性ALI 的严重程度存在相关性。此外，通过对eCIRP 与IL-6、IL-1β 表达的相关性分析，我们发现实验组大鼠中eCIRP 与IL-6、IL-1β 的表达呈正相关，表达变化趋势相同，提示eCIRP 的表达变化与炎症因子的释放影响低体温性ALI 的严重程度。因此，本研究充分提示血清eCIRP 可作为一种预测ALI 严重程度的标志物。

肺组织mRNA 和蛋白水平CIRP 的表达显示，与0 h 组相比，16 h 肺组织CIRP mRNA 水平开始升高，24 h 时肺组织iCIRP 蛋白表达显著升高，而ELISA 结果显示12 h 时eCIRP 表达升高，血清eCIRP 的增加早于肺组织的CIRP mRNA，这提示血清eCIRP 可能来自于其他组织。本研究从mRNA 水平和蛋白质水平均发现CIRP 的表达升高，并在血清中检测到eCIRP。这提示CIRP 与低体温性ALI 具有密切的相关性，对于iCIRP 和eCIRP 如何发挥作用及两者的相关性不得而知，我们推测这两者之间可能存在着一定联系，需要明晰肺组织中iCIRP 与血清中eCIRP 的转化、转移关系，肺组织中的iCIRP 是否会释放到胞外及释放途径也值得关注。

综上所述，本研究证明了CIRP 在低体温性ALI 中表达升高并发挥一定作用。首先，在大鼠低体温性ALI 模型中iCIRP 和eCIRP 的表达都有所升高，但二者在低体温性ALI 中发挥的具体作用仍未阐明。其次，本研究还发现长时间低温浸泡的大鼠出现了低血容量和低血压，导致肺组织灌注不足和组织缺氧，前期研究报道缺氧和休克均会引起CIRP 表达上调[14,23,28]，CIRP 表达增加可能还与这些机制有关。总而言之，这些结果均提示CIRP 可能在低体温性ALI 中发挥重要作用，可以作为低体温性ALI 的预测分子。CIRP 对低体温性ALI 的影响作用仍需深入探索，以期未来应用于低体温性ALI 的临床诊断。本研究对低体温性ALI 发生早期的变化特点有了新的认识，为低体温性ALI 患者的救治策略提供了实验参考。

作者贡献徐耀迪：动物实验，实验指标检测，实验数据分析处理，论文撰写；王佳新：动物实验，实验指标检测；陈旭昕、张春阳、王凡、丁毅伟：实验设计与指导；彭聪：实验数据分析处理；肖漓、韩志海：文章校对及修改。

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