超声造影联合血清miR-122-5p、miR-133a-3p水平对肝细胞癌的诊断价值

王晓静 赵晓娟 任晓转

原发性肝癌中肝细胞癌(HCC)占80%～90%[1]。HCC患者早期症状较为隐匿,易误诊为血管瘤、肝囊肿等疾病,具有较大鉴别难度[2]。患者就诊时大多已发展至中晚期,经治疗后,预后往往不理想,因此尽早诊断对改善HCC患者预后意义重大[3-4]。CEUS具有分辨率高、操作简单等优势,能够及时明确微血管、组织灌注状态,已在临床广泛应用[5-6]。此外,生物标志物中miRNAs能够调控抑癌及控癌基因的表达,参与肿瘤细胞的发生、发展过程。多项研究显示,miR-122-5p能够参与胃癌、原发性肝癌等多种恶性肿瘤进展,亦为具有肝脏特性的miRNA,可多靶点作用于肝癌的发生与发展[7-8]。miR-133a-3p能够抑制恶性肿瘤的转移及侵袭,在脓毒症、肝癌等多种疾病中均呈低表达[9-10]。但是目前如何更为有效地诊断HCC仍为临床探究的重点。因此,本研究分析CEUS联合血清miR-122-5p、miR-133a-3p水平在HCC中的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取45例HCC患者(记为HCC组)及同期在本院接受治疗的慢性乙型肝炎患者45例(记为对照组)(2020年10月至2022年10月)作为研究对象。HCC组年龄50～68岁,平均(56.78±5.72)岁;男性30例,女性15例;早期16例,晚期29例;分化程度:低分化22例,中高分化23例;浸润程度:浆膜层18例,粘膜下层27例;转移情况:淋巴结转移31例,无淋巴结转移14例;TNM分期:Ⅰ+Ⅱ期23例,Ⅲ+Ⅳ期22例。对照组年龄48～71岁,平均(57.12±5.76)岁;男性28例,女性17例。2组年龄、性别等资料比较无明显差异(P>0.05)。纳入标准:①HCC患者均符合《原发性肝癌的分层筛查与监测指南(2020年版)》[11]中相关诊断标准;②生存时间超过3个月患者;③对照组患者符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[12]相关标准;④临床资料及随访资料完整患者。排除标准:①合并高血压、糖尿病、甲亢及慢阻肺等慢性疾病患者;②有精神意识障碍患者;③依从性较差患者。本研究经伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 CEUS检测 使用多普勒诊断仪(Mindrary Resona7,Philips IU22)和C5-1凸型探头,扫描超声观察病灶回声、大小(低、等或高回声),确定目标病灶后,机械指数低于0.1,进行检查。取购自意大利Bracco的Sono Vue配置溶液2.4 mL,快速团注(经肘部浅静脉),再快速注入5 mL 0.9%氯化钠溶液。同时启动动态录像、计时器,至少观察5 min目标病灶。回顾分析病灶廓清及增强特征。记录病灶内造影剂的始消时间、持续时间、达峰时间及始增时间。

1.2.2 血清检测 抽取患者空腹静脉血3 mL,分离血清(以2500 r/min离心15 min),以Trizol法提取总RNA,测量吸光度值(A260 nm/A280 nm)(使用紫外分光光度计),A值为1.8～2.2时进行下一步实验。再进行逆转录反应(用购自德国凯杰公司的miScript II RT逆转录试剂盒),操作步骤严格按照试剂盒进行,再加入ddH2O进行稀释。本研究引物由北京康维世纪公司提供。使用购自德国凯杰公司的miScropt SYBR Green试剂盒进行qPCR反应,条件:90 ℃加热30 min,94 ℃变性15 s,55 ℃退火30 s,70 ℃延伸30 s,共40个循环。以U6为内参。计算血清miR-122-5p、miR-133a-3p的相对表达量。内参U6下游引物:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′;上游引物:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′。miR-122-5p下游引物:5′-AGUUUUGCAUGUUGCACUCAC-3′;上游引物:5′-AGUUUUGCAUAGUUGCACUCAC-3′。miR-133a-3下游引物:5′-TCCCAGCCGTAGACCAA-3′;上游引物:5′-ATTTTTCCCTCGACACCCGAT-3′。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 2组CEUS相关指标

HCC组始消时间、持续时间、达峰时间及始增时间均低于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 2组CEUS相关指标

2.2 CEUS对HCC患者的诊断价值

绘制CEUS各项指标诊断HCC的ROC曲线显示,单独检测时始增时间的敏感度最高,始消时间、持续时间的特异度最高,联合检测的AUC为0.978,特异度及敏感度均处于较高水平。见图1,表2。

图1 CEUS诊断HCC的ROC曲线

表2 CEUS诊断HCC患者的ROC曲线结果

2.3 2组患者血清miR-122-5p、miR-133a-3p水平

HCC组血清miR-122-5p、miR-133a-3p表达水平明显低于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 2组患者血清miR-122-5p、miR-133a-3p水平

2.4 血清miR-122-5p、miR-133a-3p水平对HCC的诊断价值

绘制血清miR-122-5p、miR-133a-3p水平诊断HCC的ROC曲线,单独检测时,miR-133a-3p的敏感度最高,miR-122-5p的特异度最高,两者联合检测具有较高的敏感度及特异度。见图2,表4。

图2 血清miR-122-5p、miR-133a-3p水平诊断HCC的ROC曲线

表4 多因素COX分析影响诊断HCC的因素

2.5 CEUS联合血清miR-122-5p、miR-133a-3p水平对HCC的诊断价值

CEUS联合血清miR-122-5p、miR-133a-3p水平诊断HCC的ROC曲线显示,AUC为0.999,截断值为0.712,敏感度、特异度分别为97.78%,99.99%,约登指数为0.9778,95%CI为0.958～1.000。见图3。

图3 CEUS联合血清miR-122-5p、miR-133a-3p水平诊断HCC的ROC曲线

2.6 多因素COX分析影响诊断HCC的因素

行多因素COX分析显示,始消时间、达峰时间、始增时间、血清miR-122-5p、miR-133a-3p均为影响HCC诊断的因素(P<0.05)。见表4。

3 讨论

目前,我国肝癌居肿瘤相关死亡第三位,超过全世界发病人数的50%。原发性肝癌主要以肝内胆管细胞癌及HCC为主,其中HCC占85%～90%[13]。目前,尚不清楚肝癌的发病机制,多认为是丙型、乙型肝炎病毒感染,长期酗酒、黄曲霉素摄入及致癌基因遗传等因素导致的。由于肝脏代偿能力及再生功能较为强大,肝脏受损后常无自觉症状,导致普遍的肝癌指标不能有效且全面地将所有肝癌患者筛查出来。随着分子生物学及免疫组织化学的发展,多项研究显示miRNA与肿瘤关系密切,其在肿瘤中的表达具有特异性,且在经历多次操作后,血清miRNA的表达仍较为稳定,能够作为诊断肝癌的辅助标记物[14]。其中miR-122-5p在肝脏中呈特异性高表达,能够调控免疫应答、衰老、代谢、分化及细胞发育等过程。miR-122-5p可通过结合Bcl-w、ADAM10等原癌基因,对原癌基因的表达起抑制作用,进而抑制肿瘤发展。何佳等[15]研究显示,miR-122-5p在肝癌中呈低表达,若人工干预使其表达上调则可有效抑制肝癌细胞转移及分裂。而miR-133a-3p在结直肠癌、膀胱癌、胃癌等多种恶性肿瘤呈异常表达,可抑制癌细胞迁移及增殖,参与肿瘤的发生及发展[16-17]。

因此,本研究探究血清miR-122-5p、miR-133a-3p在HCC患者中的表达情况,结果显示,HCC组血清miR-122-5p、miR-133a-3p表达水平均明显低于对照组。与张伟等[17]研究相同。说明,血清miR-122-5p、miR-133a-3p可能参与HCC的发生及发展。进一步绘制ROC曲线评估其诊断价值显示,单独检测时,miR-133a-3p的敏感度最高,miR-122-5p的特异度最高,两者联合检测具有较高的敏感度及特异度。说明两者单独检测虽具有一定价值,但是联合检测价值更高。

还有研究表明,CEUS可观察肝组织变化,显示血流信号,了解其增强类型明确肝脏及其周围组织血供,利于诊断HCC[18]。本研究通过CEUS检测HCC,结果显示,HCC组始消时间、持续时间、达峰时间及始增时间均低于对照组。说明HCC与慢性乙型肝炎存在病理差异。再通过绘制ROC曲线评估各项CEUS指标诊断HCC的价值显示,单独检测时始增时间的敏感度最高,始消时间、持续时间的特异度最高,联合检测的AUC为0.978,特异度及敏感度均处于较高水平。亦说明CEUS用于诊断HCC具有一定价值。此外,本研究还通过绘制CEUS联合血清miR-122-5p、miR-133a-3p水平诊断HCC的ROC曲线显示,AUC为0.999,截断值为0.712敏感度、特异度分别为97.78%、99.99%,约登指数为0.9778,95%CI为0.958～1.000。这说明CEUS联合血清miR-122-5p、miR-133a-3p水平诊断HCC价值较高。本研究另行多因素COX分析显示,始消时间、达峰时间、始增时间、血清miR-122-5p、miR-133a-3p均为影响HCC诊断的因素。进一步说明CEUS联合血清miR-122-5p、miR-133a-3p水平可作为临床诊断HCC的有效方式。

综上所述,CEUS联合血清miR-122-5p、miR-133a-3p水平均为影响HCC诊断的因素,三者联合检测具有较高的诊断价值。