血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p联合检测对早期鼻咽癌的诊断价值

陈 琦 崔哲卿 黄维平

鼻咽癌是起源于鼻咽部上皮的恶性肿瘤[1-3]。目前,采用常规检查方法如电子鼻咽镜检查、计算机断层扫描及磁共振成像早期发现,结合病理确诊后立即采取有效的治疗策略,近年来鼻咽癌死亡率逐渐下降,但是仍有一部分鼻咽癌患者直到疾病的晚期才被诊断出来,其对常规治疗的敏感性仍然较差[4]。鼻咽癌在早期无症状疾病状态时,由于其隐匿性,不易被发现[5]。因此,为改善鼻咽癌患者的临床预后,需要提出新颖、可靠的筛查方案。microRNA(miRNA)是一种长度约为22个核苷酸的小型非编码RNA,其功能为基因表达的转录后调节因子,在多种肿瘤中表达失调,包括鼻咽癌[6]。已经为包括鼻咽癌在内的多种癌症类型定义了预后和预测miRNA生物标志物,这些生物标志物为评估疾病状态以及预测治疗反应和临床结局提供了一个潜在的重要临床工具。因此,对鼻咽癌中表达异常的miRNAs的进一步检查和验证将有助于深入了解该病的基本驱动因素,有助于发现新的靶向治疗方法。Zou 等[7]发现早期鼻咽癌患者血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的表达水平显著高于健康对照组。但是,血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p对早期鼻咽癌的联合诊断尚未有人研究。基于此,本研究旨在探讨血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p联合检测对早期鼻咽癌的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入2017年3月至2020年3月我院收治的早期鼻咽癌患者90例为研究组,其中男53例,女37例,平均年龄(52.95±23.01)岁。鼻咽炎患者90例为炎症组,其中男性50例,女性40例,平均年龄(53.51±22.94)。早期鼻咽癌患者和鼻咽炎患者均经病理确诊。排除标准:①抽取血液前接受任何治疗的患者;②合并其他肿瘤的患者;③合并全身性自身免疫性疾病;④严重心、肝、肾功能损害者;⑤长期使用皮质类固醇激素及免疫抑制剂者。纳入2017年3月至2020年3月至我院体检的90例健康体检者为对照组,其中男性45例,女性45例,平均年龄(54.23±24.31)岁。各组一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05),可纳入此次分析。受试者均知情同意且获得我院伦理委员会批准。

1.2 RNA抽取与实时荧光定量PCR

采取90例早期鼻咽癌患者,90例鼻咽炎患者和90例健康体检者的外周血10 ml。使用北京润泽康生物科技有限公司的RNA小量提取试剂盒(货号:R6814-01)进行总RNA的抽取。用特定的逆转录(RT)引物和聚合酶链反应(PCR)对miRNA进行扩增。RT反应在42 ℃条件下进行60 min,70 ℃条件下进行10 min;PCR反应在95 ℃条件下进行20秒,然后在7900HT实时PCR系统(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)上进行40个循环,95 ℃条件下进行10秒,60 ℃条件下进行20秒,然后70 ℃条件下进行10秒。通过SYBR Green Dye (SYBR®Premix Ex TaqTM Ⅱ,TaKaRa,)释放的荧光水平计算PCR产物的相对量。采用溶解曲线分析方法评价PCR产物的特异性。2-ΔΔCt方法应用于确定miRNA的表达水平。U6作为检测miRNA相对表达水平的内参基因。引物序列:U6:(Forward primer:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′;Reverse primer:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′);miR-140-3P:(Forward primer:5′-GCGCGTACCACAGGGTAGAA-3′;Reverse primer:5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′);miR-223-3p:(Forward primer:5'-ACACTCCAGCTGGGTGTCAGTTTGTCAAAT-3';Reverse primer:5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-AGTTGAGTGGGGTAT-3');miR-192-5p:(Forward primer:5′-GGACTTTCTTCATTCACACCG;Reverse primer:5′-GACCACTGAGGTTAGAGCCA)。

1.3 统计学分析

RISM 7.0软件进行统计分析。采用Mann-Whitney U检验评估研究组、炎症组、对照组血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的表达水平差异。应用受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)分析血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p检测早期鼻咽癌的临床诊断价值。阳性临界值为ROC曲线中灵敏度-(1-特异度)的最大值所对应的数值。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 3组受试人员血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的表达水平

研究组、炎症组、对照组受试人员血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的表达水平具有显著差异(P<0.05),并且研究组受试人员血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的表达水平均高于炎症组和对照组(P<0.05)、炎症组受试人员血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的表达水平均高于对照组(P<0.05),见表1。

表1 3组受试人员血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的表达水平

2.2 两组血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的ROC曲线、AUC、灵敏度、特异度和截断值

为了评估血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p在早期鼻咽癌与鼻咽炎中的诊断价值,绘制90例鼻咽癌患者和90例鼻咽炎的ROC曲线(图1)。miR-140-3p的受试者工作特征曲线的AUC为0.90±0.03(95%CI 0.8501～0.9531),以miR-140-3p的阳性临界值1.79,其诊断灵敏度为91%,特异度为90%; miR-192-5p的受试者工作特征曲线的AUC为0.88±0.02(95%CI 0.8427～0.9370),以 miR-192-5p的阳性临界值2.04,其诊断灵敏度为89%,特异度为90%;miR-223-3p的受试者工作特征曲线的AUC为0.95±0.01(95%CI 0.9284～0.9790),以miR-223-3p的阳性临界值1.68,其诊断灵敏度为98%,特异度为94%。见图1和表2。

图1 两组血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的ROC曲线

表2 两组血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的AUC、灵敏度、特异度和截断值

2.3 两组血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的ROC曲线、AUC、灵敏度、特异度和截断值

为了评估血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p在早期鼻咽癌患者与健康体检者中的诊断价值,绘制90例鼻咽癌患者和90例健康体检者的ROC曲线(图2)。miR-140-3p的受试者工作特征曲线的AUC为0.96±0.02(95%CI 0.9296～0.9926),以miR-140-3p的阳性临界值1.09,其诊断灵敏度为96%,特异度为95%; miR-192-5p的受试者工作特征曲线的AUC为0.94±0.02(95%CI 0.9009～0.9838),以 miR-192-5p的阳性临界值1.34,其诊断灵敏度为94%,特异度为95%;miR-223-3p的受试者工作特征曲线的AUC为0.95±0.02(95%CI 0.9059～0.9844),以miR-223-3p的阳性临界值0.88,其诊断灵敏度为95%,特异度为95%。见图2和表3。

图2 两组血清中miR-140-3p,miR-192-5p,miR-223-3p的ROC曲线

表3 两组血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的AUC、灵敏度、特异度和截断值

2.4 血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p对早期鼻咽癌的联合诊断价值

患有早期鼻咽癌的为真阳性,未患有早期鼻咽癌的为真阴性。以miR-140-3p的阳性临界值1.79、miR-192-5p的阳性临界值2.04、miR-223-3p的阳性临界值1.68为诊断标准,三者均满足为联合诊断阳性,反之则为联合诊断阴性。联合诊断阳性96例(其中病理诊断阳性85例、阴性11例)、阴性174例(其中病理诊断阳性5例、阴性169例)。因此,血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p联合检测对早期鼻咽癌的诊断的的灵敏度为94.44%(85/90),特异度为93.89%(169/180),准确度为94.07%(254/270)。

3 讨论

鼻咽癌由于病变隐匿且早期症状不典型,很难早期发现和诊断。大约70%～80%的鼻咽癌患者在诊断时出现颈部淋巴结转移甚至是远处转移,这成为限制患者生存的重要因素。同时,有相当一部分鼻咽癌患者直到病情发展到晚期才被发现,导致其预后差,临床治疗效果不理想[8-9]。因此,有效的预防和预测策略是减轻鼻咽癌负担的关键。越来越多的证据表明miRNAs可能通过调控靶基因在鼻咽癌的发生中发挥重要作用。可以在血浆或血清中稳定检测到的miRNA已被证明是多种癌症类型生物标志物的稳定来源[10]。在本研究中,我们基于实时荧光定量PCR对90例早期鼻咽癌患者、90例鼻咽炎患者、90例健康体检者血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的检测和ROC曲线分析,发现血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p联合对早期鼻咽癌的诊断的灵敏度为94.44%,特异度为93.89%,准确度为94.07%。

越来越多的证据表明,miRNA与癌症生物学过程有着密切的关系[11]。miRNA作为潜在的生物标志物在包括鼻咽癌在内的各种癌症类型中具有特殊的意义[12]。与其他分子标记相比,血清中miRNA具有稳定、易于测量、样品采集过程简单、检测技术成熟等优点[13-14]。miR-140-3p对肺癌肿瘤细胞生长和侵袭有正向作用[15]。也发现其与非小细胞肺癌中miR-140/PD-L1/cyclin E通路相关,这为肿瘤免疫治疗带来了新的靶点[16]。在本研究中,发现研究组、炎症组、对照组血清中miR-140-3p的表达水平具有显著差异(P<0.05),并且研究组血清中miR-140-3p的水平均高于炎症组合对照组。因此,我们推测其在鼻咽癌患者血清中的上调可能导致肿瘤抑制功能的缺失。miR-192-5p在肝癌、胃癌和神经母细胞瘤等多种癌症中被发现上调[17]。据报道[18],它是通过调节细胞周期通路中的关键因子(如Dicer1)而成为肿瘤启动子。然而,在其他一些癌症如结直肠癌中,它经常被发现具有下调、反向抑制作用。研究发现[19],miR-192-5p通过直接靶向USP1抑制骨肉瘤的起始和进展。在本研究中,发现研究组、炎症组、对照组血清中miR-192-5p的表达水平具有显著差异(P<0.05),并且研究组血清中miR-192-5p的水平均高于炎症组合对照组。其在不同肿瘤中的复制性揭示了miR-192-5p生物学功能的复杂性。据报道[20],MiR-223-3p在卵巢癌中过表达,体外过表达MiR-223-3p通过调节性别决定区Y-box 11促进细胞增殖、迁移和侵袭。研究发现[21],miR-223-3p在DU-145和LNCaP细胞中的表达降低会降低多西紫杉醇的IC50值并提高细胞凋亡率,这表明miR-223-3p抑制剂可提高DU-145和LNCaP对多西紫杉醇的化学敏感性。因此,miR-223-3p可能是一个抗化疗因子。在化疗的同时,在合适的呈递系统的情况下,给鼻咽癌患者给予miR-223-3p inhibitor的治疗可能会提高化疗的效果。此外,虽然大多数miRNA是胞内的,但细胞外miRNA的稳定表达谱提示miRNA不仅可以被动地向外释放,还可以以某些特定的方式主动转运,从而导致表达失衡。

然而,本研究仍然有不足之处。为了扩大已识别的miRNA在血清中的诊断应用,需要进一步探索了具有不同临床病理特征的鼻咽癌患者血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的表达。例如,EBV感染是鼻咽癌发生的诱因之一[22]。爱因斯坦-巴尔病毒(EBV)在病因上与霍奇金淋巴瘤,伯基特淋巴瘤,胃癌和鼻咽癌等几种癌症相关,是第一个报道的人类肿瘤病毒。EBV的携带感染率高达90%,但只有少数人会感染鼻咽癌。因此,有理由认为不同的miRNA表达模式可能参与了鼻咽癌中某些EBV相关的生物学过程,将鼻咽癌患者分为EBV阳性和EBV阴性后值得进一步探讨血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p在此两组患者中的表达差异。

综上所述,血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的表达水平检测可作为早期鼻咽癌的潜在标志。