电子束辐照对藏药三味檀香汤散质量及灭菌效果的影响*

戈雅倩，谢和兵,4，尼玛次仁，白玛旦增

（1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；2.南通市海门长三角药物高等研究院，江苏 南通 226133；3.江苏神猴医药研究有限公司，江苏 南通 226133；4.西藏神猴药业有限责任公司，西藏 日喀则 857000）

三味檀香汤散，藏药名为赞旦松汤，记载于《四部医典》和《中华人民共和国卫生部药品标准·藏药：第一册》[1-2]。三味檀香汤散由檀香、肉豆蔻、广枣组成，是藏医治疗心热病的常用验方，具有清热、宁心、安神的功效，可用于治疗“宁彩”病及心脏病引起的心慌、胸闷、气促、口干舌燥、目赤、胸背疼痛、心前区灼痛等，临床疗效显著。研究表明其治疗心血管疾病具有较好疗效[3-8]。三味檀香汤散采用传统的藏药散剂生产工艺，将药材生药粉碎后直接入药，存在微生物无法控制的不足。目前藏药生产企业常用的湿热、干热灭菌方式，会导致檀香、肉豆蔻药材中的挥发性活性成分损失，影响疗效，不适用于本品的灭菌。本研究将电子束辐照用于藏药的灭菌工艺，对自制三味檀香汤散进行不同剂量的电子束辐照，通过比较辐照前后三味檀香汤散的性状、显微特征、指纹图谱、有效成分含量变化及其微生物含量变化，考察电子束辐照技术对藏药三味檀香汤散主要有效成分和灭菌效果的影响，旨在为藏药三味檀香汤散的灭菌方法提供实验依据，并为含生药材及挥发性药材的中药制剂的灭菌提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器 Essentia LC-16型高效液相色谱仪（配有SPD-16紫外检测器）、UV-1900i型紫外分光光度计（日本岛津公司）；XSR205DU/AC型十万分之一天平（美国梅特勒托利多科技有限公司）；WMS-1037型生物光学显微镜（上海无陌光学仪器有限公司）；UC-250DE型超声清洗仪（上海精其仪器有限公司）；TGL-16B型台式高速离心机（常州中捷实验仪器制造有限公司）；DZ-10/20型电子直线加速器（安徽戈瑞电子科技股份有限公司）。

1.2 药物与试剂 去氢二异丁香酚对照品（批号：17838-201804，纯度：98.6%）、没食子酸对照品（批号：110831-201906，纯度：91.5%）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇（批号：20220221，色谱纯）、磷酸（批号：20220321，优级纯）均购自国药集团化学试剂有限公司；水为娃哈哈纯净水；肉豆蔻（批号：210501）、檀香（批号：210801）药材均购自安徽援康中药饮片股份有限公司；广枣（批号：20200301）购自西藏神猴药业有限责任公司。肉豆蔻、檀香、广枣经江苏神猴医药研究有限公司研发部检测为正品，符合2020年版《中华人民共和国药典）》标准。

2 方法与结果

2.1 样本制备与辐照处理 分别取广枣、肉豆蔻、檀香药材粉碎，过二号筛，少量多次等比例混合均匀，分装于铝箔袋密封储存，12 g/袋，即得自制三味檀香汤散样品。所有样品均由中广核戈瑞科技有限公司采用电子束辐照灭菌处理，辐照剂量分别为2、4、6、8、10 kGy。

2.2 性状比较 通过日光下目视、手触、鼻嗅、口尝的方式对三味檀香汤散粉末样本外观、色泽、气味、味道等进行考察。以未辐照样本即0 kGy样品为参照，所有粉末呈现棕色，质柔软，气香浓烈，味辛辣、微苦。（见图1）经比较，辐照前后的样品粉末在外观、色泽、气味上无明显变化。

图1 样品性状图

2.3 显微特征 分别取不同辐照剂量下的样品少量置于载玻片上，滴加甘油醋酸试液，盖上盖玻片，置生物光学显微镜下观察，所有样品均可见大量晶纤维、淀粉粒，脐点明显，导管碎片、内果皮石细胞清晰可见，内果皮石细胞内含黄棕色物质。（见图2）说明电子加速器辐照对三味檀香汤散的显微鉴别无影响。

图2 样品显微特征

2.4 含量测定

2.4.1 色谱条件 色谱柱为Ultimate XB-C18液相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.05%磷酸（A）-甲醇（B），梯度运行程序如下：0~60 min，10%B→100%B；60~65 min，100%B→10%B，65~70 min，10%B；流速为1.0 mL/min；柱温为25 ℃；检测波长为270 nm；进样量为10 μL。

2.4.2 混合对照品溶液的制备 精密称定没食子酸对照品10.01 mg、去氢二异丁香酚对照品10.02 mg，分别用甲醇溶解于10 mL量瓶中，定容、摇匀，制得质量浓度分别为1.001 mg/mL、1.002 mg/mL的没食子酸、去氢二异丁香酚对照品储备液。精密移取没食子酸对照品储备液3.0 mL、去氢二异丁香酚对照品储备液8.0 mL于同一25 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到没食子酸、去氢二异丁香酚质量浓度分别为0.120、0.321 mg/mL的混合对照品溶液。

2.4.3 供试品溶液的制备 取三味檀香汤散约1 g，精密称定，置于150 mL具塞锥形瓶中，精密加入10 mL的70%甲醇溶液，称定质量，超声处理（功率：250 W，频率：40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，离心5 min，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

2.4.4 系统适用性试验 将提取溶剂、混合对照品溶液、供试品溶液按“2.4.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。（见图3）提取溶剂作为空白，所得色谱图在没食子酸、去氢二异丁香酚保留时间处无干扰峰出现。没食子酸、去氢二异丁香酚分别与相邻色谱峰的分离度大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05之间，理论塔板数按没食子酸峰和去氢二异丁香酚峰大于3 000计。色谱系统适用性试验符合含量测定要求。

图3 HPLC 图

2.4.5 线性关系考察 精密吸取没食子酸和去氢二异丁香酚的混合对照品溶液0.10、0.50、1.50、3.00、4.50、6.00 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，配成不同质量浓度的混合对照品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进行测定。分别以两种成分的质量浓度（mg/mL）为横坐标X，色谱峰面积积分值为纵坐标Y，绘制标准曲线并进行回归分析计算。结果显示，没食子酸在0.001 20～0.072 00 mg/mL范围内与峰面积积分呈良好的线性关系，回归方程为Y=3.83×107X－1.47×105（r=0.999 9）；去氢二异丁香酚在0.003 20～0.192 00 mg/mL范围内与峰面积积分呈良好的线性关系，回归方程为Y=4.02×107X＋1.24×105（r=0.999 9）。（见图4）

图4 线性关系图

2.4.6 精密度试验 按“2.4.3”项下方法制备均匀供试品溶液。按“2.4.1”项下色谱条件连续进样6次，测得没食子酸成分峰面积的RSD（n=6）为0.65%，去氢二异丁香酚峰面积的RSD（n=6）为0.43%，表明仪器精密度良好。

2.4.7 稳定性试验 取三味檀香汤散样品，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，分别在常温放置0、2、4、9、14、24 h，按“2.4.1”项下色谱条件进样分析，没食子酸峰面积的RSD（n=6）为1.02%，去氢二异丁香酚峰面积的RSD（n=6）为1.07%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.8 重复性试验 取三味檀香汤散样品，按“2.4.3”项下方法平行制备供试品溶液6份，按“2.4.1”项下色谱条件进样分析，测得没食子酸含量的RSD（n=6）为1.17%，去氢二异丁香酚含量的RSD（n=6）为0.76%，表明方法重复性良好。

2.4.9 加样回收率试验 取已知含量的三味檀香汤散样品6份，每份约0.5 g，精密称定。分别精密加入已知含量的混合对照品溶液，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.4.1”项下色谱条件进行测定，计算没食子酸和去氢二异丁香酚的平均加样回收率和RSD值。（见表1）

表1 加样回收率结果 （n=2）

2.4.10 样品测定 取不同剂量辐照后的三味檀香汤散样品，按“2.4.3”项制备供试品溶液，按“2.4.1”项进样分析，记录色谱图。外标法计算没食子酸和去氢二异丁香酚含量，运用SPSS 26.0软件进行数据处理，两组间比较采用成组t检验。结果显示，不同剂量辐照后的三味檀香汤散的主要有效成分没食子酸和去氢二异丁香酚含量与未辐照样本（0 kGy辐照）比较，差异无统计学意义（P>0.05）。（见表2）

表2 样品的含量测定结果 （n=3）

2.5 指纹图谱相似度考察 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”对所得色谱图进行处理，以0 kGy供试品色谱图为参照，经过多点校正、全谱峰匹配，生成对照图谱R。（见图5）样品相似度结果均≥0.996。（见表3）

表3 样品指纹图谱相似度

图5 样品的指纹图谱

2.6 微生物限度检测 参照2020年版《中华人民共和国药典》四部通则1105微生物计数法、1106控制菌检查法和1107非无菌药品微生物限度标准（需氧菌总数≤2×103cfu/g，霉菌、酵母菌总数≤200 cfu/g，控制菌大肠埃希菌不得检出），对三味檀香汤散样品粉末的细菌菌落总数、霉菌和酵母菌总数及大肠菌群进行随机抽样检查。（见表4）结果显示，三味檀香汤散样品经过辐照后细菌菌落数、霉菌和酵母菌菌落总数均降低（P<0.05），大肠菌群在辐照前后均未检出；当辐照剂量为4 kGy时，微生物限度已满足规定标准，当达到6 kGy及以上时微生物均未检出。

表4 样本的微生物限度检测结果 （n=2）

3 讨论

3.1 电子束辐照应用于藏药灭菌的优势 藏医药是祖国传统医学璀璨的一脉，更是传统文化的重要组成部分，传承发展意义重大，但受高原地区经济社会发展等因素的制约，藏药存在剂型单一、质控水平低等不足。传统藏药制剂多以生品药粉直接入药制成丸剂、散剂[9]，导致产品微生物限度很难符合《中华人民共和国药典》规定。

电子束辐照灭菌可利用电子加速器产生的高能电子束照射物料达到杀灭微生物的目的[10]。与传统的钴-60辐照比较，电子束辐照灭菌具有辐照束流定向、能量利用充分、不产生核废料、无环境污染等优点。随着国内电子加速器制造技术的不断进步，电子束辐照在中药、医疗器械、食品、卫生材料灭菌领域广泛使用[11-15]，但对藏药的辐照灭菌研究较少[16]。此外，电子束辐照灭菌与目前常规使用的湿热、干热、紫外线、环氧乙烷灭菌等比较，最大的优势在于电子束辐照属于冷灭菌技术，不改变物料的温度，并且穿透性高，灭菌效率高，尤其适用于含生药材粉末及挥发性成分较多的藏药灭菌[17]。

3.2 主要有效成分的选择 现代药理研究表明，没食子酸是广枣药材的主要有效成分之一，具有保护心血管、保护神经系统、抗炎、抗氧化等作用[18-22]。去氢二异丁香酚是肉豆蔻药材的主要有效成分之一，具有较强的抑菌、抗炎、抑制肝内脂质氧化等作用[23-25]。同时，二者也是2020年版《中华人民共和国药典》规定的药材含量测定指标成分[26]，因此，本研究选择去氢二异丁香酚和没食子酸作为本品的主要有效成分。

3.3 含量测定方法学研究 本研究采用紫外分光光度计进行全波长（190～700 nm）扫描，结果显示没食子酸在270 nm处有最大吸收；去氢二异丁香酚在274nm处有最大吸收，在270 nm处也有较大吸收。综合二者吸收峰走势与分别在270 nm和274 nm处的吸收值测定结果变化情况，本研究选择270 nm作为检测波长。本研究在流动相优选时分别考察了磷酸-甲醇溶液和醋酸-甲醇溶液的分离效果，前者所得样品峰分离度明显优于后者，故选择磷酸-甲醇溶液作为流动相。主要指标成分没食子酸与去氢二异丁香酚的极性差异较大，采用单一流动相无法将两者分离，并呈现于同一张色谱图，故本研究采用梯度洗脱的方式，同时对两种成分进行定量测定。

3.4 辐照剂量的选择 本研究遵循2015年国家食品药品监督管理总局发布的《中药辐照灭菌技术指导原则》，设置2、4、6、8、10 kGy的辐照剂量梯度，以确保中药的安全、有效、质量稳定。通过与未辐照样品比较，当辐照剂量为2 kGy时，微生物含量明显下降。当辐照剂量为4 kGy时，微生物含量即可满足《中华人民共和国药典》标准，杀菌效果显著，且该剂量对主要有效成分含量无明显影响，指纹图谱相似度≥0.996。

4 结论

不同剂量的电子束辐照对藏药三味檀香汤散的各项指标均无明显影响，且可明显降低药材的微生物水平。辐照剂量为4 kGy时可达到良好的灭菌效果。因此，电子束辐照灭菌是一种有效控制藏药三味檀香汤散微生物水平的方法，并对药品质量无明显的影响。本研究可为藏药三味檀香汤散的辐照灭菌工艺提供参考，同时也为含有生药的藏成药制剂的灭菌提供新思路。此外，本研究建立了高效液相色谱梯度洗脱法同时对三味檀香汤散中的指标成分没食子酸、去氢二异丁香酚进行定量测定，可用于三味檀香汤散的质量评价，并为本品的质量标准的提升提供参考。