茵陈四苓汤对酒精性肝损伤大鼠肠黏膜屏障ZO-1及occludin的影响*

王曼菲，肖肽平，赵好好，马祺鑫，艾碧琛

（湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD），又称为酒精性肝损伤，是由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病。ALD初期通常表现为单纯性脂肪肝，进而可发展成酒精性肝脂肪变、酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化，严重酗酒时可诱发广泛肝细胞坏死，甚至肝功能衰竭[1]。研究表明，ALD的主要病因是乙醇的过度摄入，但该疾病的发生发展过程则与多种因素有关[2]。肠黏膜屏障（intestinal barrier function，IBF）是阻止肠道内细菌及内毒素进入的第一道防线。自1988年马歇尔提出“肠-肝轴”理论后[3]，肠黏膜屏障及其功能在ALD形成过程中的作用及机制逐渐成为研究热点。近年来，大量研究[4-6]表明酒精可造成肠道损伤，使得肠道通透性增加，引起内毒素（lipopolysaccharide，LPS）肠渗漏。LPS具有高度的免疫活性，可随着ALD进展而泛滥进入循环系统，激活炎症因子，导致促炎症因子瀑布式释放，形成肠源性内毒素血症（intestinal endotoxemia，IETM），对肝脏进行第二次打击，诱导并加重肝损伤，同时又可加剧肠黏膜屏障的损害，形成恶性循环。因此，临床对于肝病的防治日益重视对IBF的保护，了解肠黏膜屏障在ALD中的保护作用并探讨其相关性具有重要的临床意义。茵陈四苓汤出自《杏苑春生》，具有清热利湿、利胆退黄的功效[7]。实验研究显示，茵陈四苓汤具有护肝抗炎、改善肝纤维化的作用[8]。临床研究也证实，茵陈四苓汤治疗以湿热为主的肝病效果显著[9-10]。本研究以肠黏膜机械屏障为中心，通过观察茵陈四苓汤对酒精性肝损伤大鼠肠黏膜血清闭锁小带蛋白-1（Zonula occludens-1，ZO-1）和闭锁蛋白（occludin）的影响，探讨本方防治ALD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠50只，体质量（180±20）g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，生产许可证号：SYXK（湘2019-0009），动物合格证号：SCXK（湘）2019-0004。饲养于SPF级动物饲养室，室温20~26 ℃，每笼2~3只，自由饮水及进食，每日交替12 h的光明与黑暗周期。本研究已通过湖南中医药大学动物伦理委员会的审核，实验过程中严格按照《实验动物管理条例》，遵循人道主义原则，确保实验动物的福利伦理，批准编号为：LL2021032404。

1.2 药物与试剂 双环醇（北京协和药厂，规格：25mg×18粒/盒，批号：201204）；茵陈四苓汤（方药组成：茵陈、泽泻、白术各15 g，枳实、猪苓各10 g，山栀子6 g），饮片购于湖南中医药大学第一附属医院；高脂饲料[11-13]（77.5%基础饲料+10%猪油+2%蔗糖+8%蛋黄粉+2%胆固醇+0.5%胆盐），由湖南中医药大学动物实验中心提供；白酒为乙醇体积分数为56%的北京红星二锅头。总胆固醇（TC）试剂盒（批号：10412001H）、甘油三酯（TG）试剂盒（批号：10408002H）、谷丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒（批号：20210728-J8477）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒（批号：20210728-J8478）、脂多糖（LPS）试剂盒（批号：20210728-J3243）、大鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）试剂盒（批号：20210728-J3056）、大鼠白细胞介素10（IL-10）试剂盒（批号：20210728-J3071）均由湖南艾方生物科技有限公司提供。

1.3 主要仪器 真空采血管（山东省成武县华博医疗器械有限公司，普通管、EDTA2K）；离心沉淀机[微量高速离心机（国产），TG16W]；电热恒温培养箱（武汉一恒苏净科学仪器有限公司，DHP-9012）；移液枪（Finnpipette，4641020N）；洗板机（Tianshi，988洗板机）；酶标仪（Rayto，RT-6100）；恒温摇床（上海赫田科学仪器有限公司，HT-111B）；荧光分光光度计（BioTeck，Epoch）。

1.4 造模与分组 采用高脂饲料加白酒灌胃方式建立酒精性肝损伤模型[14-16]。50只大鼠适应性喂养1周后，按照随机数字表法分为空白组（n=15）和实验组（n=35）。空白组予普通饲料喂养，蒸馏水灌胃；其余大鼠用高脂饲料喂养，用乙醇体积分数为56%的白酒灌胃。各组大鼠灌胃量为1 mL/100 g，每周记录体质量1次，根据体质量调整灌胃量。因酒精过敏、灌胃操作不当、大鼠之间斗殴等导致部分大鼠在实验过程中死亡。12周后，随机抽取空白组（n=11）及实验组（n=22）大鼠各5只，检测肝功能并取相同部位肝组织HE染色观察组织形态学改变，若实验组大鼠出现明显的肝细胞脂肪变、气球样变及部分炎症细胞浸润，且肝功能与空白组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），则造模成功。

1.5 实验给药 将造模成功的17只实验组大鼠，按随机数字表法分为模型组、双环醇组、茵陈四苓汤组（以下简称茵四组），分别为5只、6只、6只。根据人与动物体表面积-剂量换算法，以70 kg成人剂量进行换算，按照茵陈四苓汤组成比例，将所有药物浸泡1 h后，水煎2次，每次30 min，合并2次滤液，将茵陈四苓汤浓缩至含生药1.07 g/mL，双环醇以0.5%CMC-NA水溶液配制成100 mg/10 mL混悬液，置于4 ℃冰箱保存备用。双环醇组及茵四组大鼠给予相应药液灌胃，空白组及模型组大鼠以蒸馏水灌胃，每次灌胃量为1 mL/100 g，每日2次（09:00:00和15:00:00各1次），连续给药4周。每周称体质量1次，以便根据体质量调整灌胃量。

1.6 观察指标 末次给药后，各组大鼠禁食不禁水12 h，予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，打开腹腔，腹主动脉采血，2000r/min离心15 min后，提取血清及血浆，置于-20 ℃冰箱保存备用；切除完整肝脏，取肝左叶部分肝组织装入EP管中，用液氮速冻，-80 ℃保存，另取肝左叶5 mm×5 mm×5 mm大小肝组织，置于4%多聚甲醛溶液固定；取临近回盲部（＜4 cm）的近端结肠组织，用4%多聚甲醛固定。

1.6.1 一般情况 观察大鼠的精神状态、体质量及死亡情况。

1.6.2 肝组织病理学观察 取肝组织，4%多聚甲醛固定，常规脱水处理、石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察肝组织病理学改变。

1.6.3 血清相关生化指标及血浆内毒素测定 采用ELISA检测血清ALT、AST、TC、TG水平；提取血浆，用ELISA法检测LPS含量，以上操作均严格按照试剂盒说明书进行。

1.6.4 激活KCs后的炎症反应 取部分肝组织，用ELISA法检测肝脏组织TNF-α及IL-10水平，观察LPS激活KCs后的炎症反应。具体操作均严格按照试剂盒说明书进行。

1.6.5 结肠组织ZO-1、occludin表达 取结肠组织，用免疫组化法检测相关蛋白表达。每组选取5个样本，分别随机观察3个视野，通过Image Pro Plus测定阳性表达的灰度值和面积，计算平均吸光度（MOD）。

1.7 统计学方法 采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析。计量资料以“均数±标准差“（±s）表示，多组间比较采用单因素方差（ANOVA）分析，两两比较满足方差齐性用LSD法，不满足方差齐性则选用Dunnett’T3检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较 空白组大鼠体型正常，皮毛有光泽，精神佳，活动灵活，饮食正常；模型组、双环醇组、茵四组大鼠体型较胖，毛色枯槁晦暗，精神欠佳，倦怠，食量减少。

2.2 各组大鼠肝组织病理形态观察 空白组大鼠肝小叶结构清晰，肝索排列整齐，呈放射状，肝细胞形态规则，无明显脂肪样变，未见明显炎症细胞浸润及坏死。模型组大鼠肝细胞体积增大，细胞内出现大量的脂肪细胞堆积，可见大量脂滴空泡形成，肝索排列紊乱，肝窦挤压变窄，伴有不同程度炎症细胞浸润、坏死，可见气球样变或纤维样变。双环醇组和茵四组肝细胞较模型组脂肪变性均有改善，程度不等，肝索排列也相对整齐，肝细胞形态尚规则，炎症浸润情况也明显减轻。（见图1）

图1 各组大鼠肝组织形态 （HE 染色，×200）

2.3 各组大鼠血生化结果及LPS水平比较 与空白组比较，模型组大鼠血清ALT、AST、TC、TG、LPS水平均升高（P＜0.01）；与模型组比较，双环醇组及茵四组大鼠血清ALT、AST、TC、TG、LPS水平均降低（P＜0.05或P＜0.01）。（见表1）

表1 各组大鼠血清ALT、AST、TC、TG、LPS 比较 （±s）

表1 各组大鼠血清ALT、AST、TC、TG、LPS 比较 （±s）

注：与空白组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.01；与双环醇组比较，dP＜0.05，eP＜0.01。

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2.4 各组大鼠肝组织TNF-α、IL-10水平比较 与空白组比较，模型组大鼠肝组织TNF-α水平升高（P＜0.01），IL-10水平降低（P＜0.01）；与模型组比较，双环醇组及茵四组大鼠肝组织TNF-α水平均降低（P＜0.01），IL-10水平均升高（P＜0.01）。（见表2）

表2 各组大鼠肝组织TNF-α、IL-10 水平比较 （±s，pg/g）

表2 各组大鼠肝组织TNF-α、IL-10 水平比较 （±s，pg/g）

注：与空白组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01，与双环醇组比较，cP＜0.01。

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2.5 各组大鼠结肠组织ZO-1、occludin表达比较 空白组大鼠结肠ZO-1、occludin阳性表达较多，黏膜上皮细胞着色较深，呈棕褐色；模型组大鼠结肠组织ZO-1、occludin相对减少，着色较浅；双环醇组与茵四组大鼠结肠组织阳性表达与模型组相比有所增加，着色程度也有不同程度加深。（见图2）与空白组比较，模型组大鼠结肠组织ZO-1、occludin蛋白表达降低（P＜0.01）；与模型组比较，双环醇组及茵四组大鼠结肠组织ZO-1、occludin表达升高（P＜0.01）。（见表3）

图2 各组大鼠结肠组织ZO-1、occludin 蛋白表达 （免疫组化，×200）

表3 各组大鼠结肠组织ZO-1、occludin表达比较（±s，MOD）

表3 各组大鼠结肠组织ZO-1、occludin表达比较（±s，MOD）

注：与空白组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01。

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3 讨论

酒精性肝损伤已成为欧美等发达地区肝硬化形成的首要病因，其发病机制错综复杂。近十余年来研究显示，除酒精大量蓄积引起肝损伤外，肠道微生物组成比例改变，即生态失调、微生物及其代谢产物、细菌易位导致肠道屏障功能障碍、内毒素血症、机体免疫损伤也被认为是引发ALD的中心环节。越来越多的研究者们开始拓宽视野，逐渐将目光转移到与肝病发生发展有关的其他因素及其关系中，而肝脏与肠道的关系正是目前被关注的重点。已有研究证实肠黏膜屏障参与肝功能恶化及肝性脑病的发生发展[17]。

肠和肝的紧密联系始于胚胎发育期，他们共同起源于腹侧前肠内胚层[18]。两者在生理病理上紧密联系，双向沟通[19]。一方面，肝脏通过胆管排泄胆汁及其他生物活性介质与肠道沟通，影响肠道微生态；另一方面，代谢营养物通过门静脉运输到肝脏，同时肠道细菌及其产物、内毒素和炎症介质也会通过门静脉转运，从而使得肝脏易受肠道微环境的影响而发生病理性改变。当肠黏膜屏障结构及功能受损时，肠黏膜通透性增加，肠道中大量细菌、内毒素及炎症因子通过门静脉进入肝脏；慢性肝病发生时，若肠黏膜通透性增加，进入体循环的内毒素含量也随之增加，从而引发内毒素血症造成肝微循环障碍，对肝脏进行第二次打击，加重肝脏疾病[20]。大量研究[21-23]证实，酒精性或非酒精性脂肪肝、肝纤维化、肝硬化等肝脏疾病的发生发展均与“肠-肝轴”有着密切关系。因此，“肠-肝轴”理论为肝脏疾病的治疗打开新的思路——从肠治肝[24]。

内毒素是脂多糖的活性成分，而肠黏膜屏障正是防止其进入体循环的第一道防线。肝脏固有免疫系统也发挥着重要的防御作用。对于那些逃逸的内毒素，作为第二防线的肝脏可通过胞饮的形式将其吞噬，从而维持内环境稳定。无论是IBF功能障碍还是肝脏功能受损均可导致体内LPS的蓄积。LPS通过影响肝脏微循环直接损伤肝细胞，破坏肝窦内皮细胞和微血管，激活凝血系统，导致微血栓形成，加重肝细胞损伤和加快肝纤维化过程。此外，LPS还可通过影响炎症因子、内源性介质等间接造成肝损伤，LPS与细胞膜上的受体结合后激活肝内外单核-巨噬细胞系统，通过丝裂原活化蛋白激酶通路、PKC通路、NF-κB通路[25]等，诱导细胞内肿瘤坏死因子TNF-α、IL-10、NO等多种炎症介质大量生成、释放。因此明确LPS与ALD的关系，减轻炎症反应，在治疗ALD等慢性肝病方面至关重要。

本研究中，与空白组比较，模型组大鼠LPS水平显著升高（P＜0.01），说明在高脂饲料加白酒刺激下模型组大鼠肠源性内毒素血症形成。经治疗后，与模型组比较，双环醇组及茵四组LPS水平明显降低（P＜0.01）；茵四组LPS水平低于双环醇组，差异有统计学意义（P＜0.05），说明茵陈四苓汤对减轻ALD模型大鼠血浆内毒素水平疗效明显，且茵陈四苓汤对于ALD模型大鼠体内LPS水平的改善效果优于双环醇。模型组大鼠TNF-α水平显著升高（P＜0.01），作为抗炎因子的IL-10水平则明显降低（P＜0.01），说明模型组大鼠肝脏炎症反应明显。经治疗后，双环醇组及茵四组TNF-α水平明显低于模型组（P＜0.01），IL-10水平也有所上升（P＜0.01）。说明茵陈四苓汤能有效降低ALD模型大鼠的TNF-α水平，激发抗炎因子释放，改善炎症反应，从而减少对肝脏的进一步损伤。除了降低LPS水平，减轻炎症反应外，恢复肠道通透性、改善肠黏膜屏障功能也可以治疗ALD。ZO-1和occludin是肠黏膜机械屏障中最重要的结构蛋白，可阻止细菌微生物、代谢产物和毒素的侵入，对肠黏膜屏障功能的正常发挥起着直接作用。本研究发现，经茵陈四苓汤治疗后，ALD大鼠ZO-1、occludin表达增加（P＜0.01），ALT、AST、TC、TG水平均明显降低（P＜0.05），说明茵陈四苓汤对肠黏膜机械屏障具有修复作用并能改善肝功能，调控脂代谢，这一结果论证了从肠治肝的可行性及有效性。

现代医学所讨论的肠道功能可归于中医“脾胃”所主范畴，而解剖学的肝脏则可与中医“肝”的范畴相对应。肝脾理论的运用早在东汉时期就有所体现，如《金匮要略》中记载“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”[26]。这句话不仅阐述了肝病的传变规律，还在《难经》的基础上补充了治法。肝木患病易乘脾土。这既是中医整体观念的体现，也是对治未病思想的实践。“实脾，则肝自愈”，因此，在治疗肝病的同时，重视调补脾气，使脾脏健运正常，不受邪侵，才能早日康复。此外，脾病亦可侮肝，早在《黄帝内经》[27]中便提出了相关理论：“气有余，则制己所胜而侮所不胜；其不及，则己所不胜，侮而乘之，己所胜，轻而侮之”。肝病实脾、肝脾同治的学术思想一直被世人推崇并逐渐完善。如清代叶天士言“补脾必以疏肝，疏肝即以补脾也”，临证多重视肝脾同调；张锡纯在《医学衷中参西录》[28]中介绍到：“欲治肝者，原当升脾降胃，培养中宫，俾中宫气化敦厚，以听肝木自理”；再到后来“肠-肝轴”学说的提出。不难发现，西医所提出的“肠-肝轴”实际上是对与中医肝脾相关理论另一角度的补充。

中医学认为ALD系酒酪不节所致，常与湿热侵袭、情志不畅相关。大量饮酒造成脾胃运化失司，湿热困脾，脾失健运，水湿内生，痰瘀互结，阻滞肝脉。脏腑上与肝脾最为密切，病机不外“湿热”“气滞”，辨证多属湿热内蕴，其特点为本虚标实。茵陈四苓汤由茵陈、白术、泽泻、猪苓、山栀子、枳实组成。方中茵陈性微寒，味苦辛，归脾、胃、肝、胆经，具有清利湿热、利胆退黄的功效，使体内稽留之湿热毒邪外出，同时还可畅达肝气，使气机升降功能得以恢复。现代研究表明，茵陈所含有的茵陈多肽能增强巨噬细胞的吞噬能力，降低TNF-α水平从而减轻炎症反应，保护肝脏。此外，茵陈与山栀子合用还能稳定肝细胞膜，减少肝细胞凋亡，从而促进肝脏功能的恢复。白术归脾、胃经，味甘苦，性温，具有益气健脾、燥湿利水之功，用以恢复脾土治水之功，顾护后天之本。泽泻性寒，味甘、淡，归肾、膀胱经，可利水渗湿泄热。现代药理研究发现其具有利尿、抗炎、降脂、护肝的作用[29]。猪苓味甘、平，性微热，归心、脾、胃、肺、肾经，具有祛寒利水、消肿渗湿之功效。山栀子性寒，味苦，入心、肝、肺、胃经，可入血分，加强清热利湿凉血之效。枳实性微寒，味苦、辛、酸，归脾、胃经，可以破气消积，化痰散痞。《神农本草经》中记载枳实还具有“长肌肉，利五脏，益气轻身”的功效。诸药合用，共奏清热解毒、利水渗湿、凉血止血、利胆退黄的功效，可用于治疗酒精性肝损伤之湿热蕴结证。根据上述“肠-肝轴”及肝脾相关理论，本方从“脾”入手，通过健运脾胃修复肠屏障功能从而达到“治肝”的目的。

综上，茵陈四苓汤可增加ALD大鼠结肠ZO-1、occludin表达，调节炎症因子TNF-α、IL-10水平，保护肠黏膜屏障，从而降低内毒素水平，改善肝功能，调控血脂。提示茵陈四苓汤可调节“肠-肝轴”，也为临床“从肠治肝”防治慢性肝病提供了实验依据。