当归多糖通过Akt/GSK-3β通路增强Nrf2信号传导对高糖诱导视网膜神经节细胞凋亡的抑制作用*

王艳新，贾冠美，曹 朗，曹顺义，张士宏

（保定市第二中心医院，河北 保定 072750）

糖尿病视网膜病变（diabetes retinopathy, DR）是临床中糖尿病引起的常见并发症之一，可引起患者视力损伤和失明[1]。视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells, RGCs）是视神经的重要组成部分，高糖环境下诱导RGCs凋亡是DR病程进展的重要过程。RGCs的凋亡会引起视网膜毛细血管病变，致使患者失明[2-3]。因此亟需寻找安全有效、毒副作用低的治疗药物。当归多糖是提取自中药当归的主要成分，具有抗氧化损伤、抗炎、降血糖、降血脂等药理作用[4-5]，常用于治疗视神经损伤。研究表明，当归多糖可通过减少氧化应激反应，缓解青光眼大鼠视神经损伤症状，但其作用机制尚不明确[6-7]。因此，本研究拟通过高糖处理的大鼠RGCs建立高糖损伤模型，检测当归多糖对高糖损伤诱导的RGCs氧化应激状态的改善作用及其对凋亡情况的影响，旨在为当归多糖药物开发及临床治疗DR提供参考依据。

1 材料

1.1 细胞 SD大鼠视网膜神经节细胞RGC-5购于中国科学院上海生科院细胞资源中心（BFN608006377）。

1.2 试剂 当归多糖（纯度≥98%，西安金萃坊植物技术开发有限公司，批号：20190517）；Nrf2信号通路抑制剂（ML385）（北京百奥莱博科技有限公司，批号：20211020）；MTT溶液（美国Sigma公司，批号：M2128）；DMSO（美国Sigma公司，批号：D2650）；丙二醛（malondialdehyde, MDA）ELISA试剂盒（批号：20200117）、超氧化物岐化酶（superoxide dismutase, SOD）ELISA试剂盒（批号：20191202）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）ELISA试剂盒（批号：20200109）均购自南京建成生物工程研究所；兔抗β-actin多克隆抗体（批号：#4970）、兔抗鼠凋亡蛋白B细胞淋巴瘤因子2（b-cell lymphoma factor 2, Bcl-2）多克隆抗体（批号：ab21726）、Bcl-2相关蛋白（bcl-2 related x protein, Bax）多克隆抗体（批号：ab32503）、Caspase-3（批号：ab184787）多克隆抗体、Caspase-9多克隆抗体（批号：ab182648）、山羊抗兔二抗IgG（批号：ab205718）均购自美国Cell Signaling公司；DMEM细胞培养基（批号：M4530）、胎牛血清（批号：F8687）、0.25%胰蛋白酶（批号：T4049）均购自美国Sigma公司。

1.3 主要仪器 SW-CJ2-1F型超净工作台（苏州安泰技术有限公司）；BIOFUGE28RS型低温高速离心机（德国HERAEUS公司）；7500型荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。

2 方法

2.1 MTT检测细胞存活情况 待RGC-5细胞复苏、传代后，收集对数生长期细胞，采用MTT实验检测不同浓度当归多糖对RGC-5细胞活力的影响。胰蛋白酶将细胞消化重悬，制备细胞浓度为1×104个/mL的细胞悬液，接种至96孔板中，每孔约100 μL细胞悬液。每孔分别给予0、25、50、100、200、400 μmol/L的当归多糖处理细胞，放入37 ℃、含有5%CO2的细胞培养箱培养24h。取出细胞，吸去培养液，向各孔加入MTT溶液（5mg/mL）20μL，继续培养4h，再加入DMSO溶液150μL，温和振荡10 min。将96孔板置入酶标仪中于（OD）波长490 nm处检测各孔吸光度值，实验重复3次。细胞存活率（%）=OD实验组/OD对照组×100%。

2.2 模型建立与分组 将RGC-5细胞常规培养于含有10%胎牛血清的普通DMEM细胞培养基内，置于37 ℃、含有5%CO2的细胞培养箱中，待细胞贴壁生长，生长密度达到80%时，取对数生长期细胞经胰蛋白酶消化重悬后用于实验。在RGC-5细胞培养基内加入50 mmol/L葡萄糖建立高糖损伤模型[8-9]，然后分为高糖组、当归多糖组和当归多糖+ML385组，另设对照组。当归多糖组使用100 μmol/L的当归多糖处理，当归多糖+ML385组使用100 μmol/L的当归多糖联合20 μmol/L的ML385处理，高糖组使用50 mmol/L葡萄糖处理，对照组加入等量完全培养基。

2.3 CCK-8法检测细胞生长活力 收集对数生长期RGC-5细胞，胰蛋白酶消化重悬后接种于96孔板中，每孔中细胞约1×104个，各组细胞加入相应药物进行干预后，置于37 ℃、含有5%CO2的恒温培养箱中48 h，弃去培养液，每孔加入CCK-8溶液10 μL，再于37 ℃培养箱孵育3 h。将96孔板置入全自动酶标仪中于450 nm波长处检测各孔吸光度值，计算细胞存活率。每组设置3个复孔，结果取平均数，实验重复3次。

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡情况 收集对数生长期的RGC-5细胞，4 ℃预冷PBS溶液，使用预冷的PBS溶液重悬细胞制备细胞悬液，以每孔1×105个细胞接种于6孔板中，各组加入相应药物干预48 h。弃去原培养液，PBS溶液清洗2次，每孔加入Annexin V-FITC液5 μL，避光孵育10 min，离心重悬细胞后加入PI染液5 μL，避光孵育5 min。使用流式细胞分析仪检测各组细胞凋亡情况。

2.5 氧化应激水平检测 取对数生长期细胞RGC-5进行实验，各组加入相应药物干预48 h后，用胰蛋白酶消化为细胞悬液，将细胞悬液浓度调整为5×105个/mL。提前取出ELISA试剂盒，待试剂盒平衡至室温后开始实验。使用ELISA法严格按照试剂盒说明书操作，检测各组MDA、GSH-Px、SOD含量。使用酶标测定仪于450 nm波长处检测OD值，根据标准曲线计算样品浓度。

2.6 RT-PCR检测Akt mRNA、GSK-3β mRNA、Nrf2 mRNA表达 取各组对数生长期RGC-5细胞，加入相应药物干预48 h后弃去原培养液，加入适量TRIzol试剂裂解细胞，TRIzol沉淀法提取细胞总RNA，检测各组细胞中蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）mRNA、糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3 β,GSK-3β）mRNA和核因子E2相关因子2（nuclear factor E2 and related factor 2, Nrf2）mRNA表达情况。紫外分光光度计检测总RNA浓度并鉴定纯度，反转录试剂盒合成cDNA。配制PCR反应液：2×PrimeScript Enzyme Mix10μL，cDNA样品2 μL，上、下游引物各1 μL，RNase Free ddH2O 6 μL。反应程序设置为：94 ℃5 min，94 ℃30 s，59 ℃30 s，72 ℃30 s，共循环40次。反应结束后，根据测得样品的循环阈值（CT值），以2-△△CT法计算目的基因与内参基因的相对表达量，比较各样本之间基因表达差异。引物序列见表1。

表1 引物序列

2.7 Western blotting检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达 取对数生长期RGC-5细胞进行实验，各组加入相应药物干预48 h后，TBS缓冲液清洗细胞2次，加入适当体积细胞蛋白提取剂与蛋白酶抑制剂，作用3 min，期间反复摇晃培养板，使液体与细胞充分接触。收集上清液，BCA试剂盒测定蛋白样品浓度。确定蛋白上样量，配制电泳SDS-PAGE凝胶与缓冲液，灌胶后加入蛋白样品，电泳至溴酚蓝到达胶板下沿。准备好转膜滤纸，300 mA转至PVDF膜，加入含有脱脂牛奶的封闭液室温孵育2 h，除去封闭液，加入1∶1 000稀释一抗4 ℃孵育过夜；室温下TBST清洗3次后加入1∶3 000稀释二抗，摇床封闭2 h。滴加ECL混合液暗室中避光显色，曝光系统进行显影、定影，扫描胶片存档，应用图像分析软件观察并分析相应条带。

2.8 统计学方法 使用SPSS 23.0统计学软件分析数据，计量资料符合正态分布采用“均数±标准差”（x±s）表示，数据方差齐，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 当归多糖对细胞活力的影响 MTT实验结果显示，不同浓度当归多糖（0、25、50、100、200、400 μmol/L）作用于RGC-5细胞后，各组细胞存活率均明显降低，且呈现浓度依赖性（P<0.05）。25、50、100、200、400 μmol/L当归多糖组细胞存活率明显低于0 μmol/L当归多糖组（P<0.05）。当归多糖作用于RGC-5细胞24 h的IC50约为100 μmol/L，所以后续实验当归多糖给药浓度为100 μmol/L。（见表2）

表2 各组细胞存活率比较 （±s）

表2 各组细胞存活率比较 （±s）

注：与0 μmol/L当归多糖组比较，aP<0.05；与25 μmol/L当归多糖组比较，bP＜0.05；与50 μmol/L当归多糖组比较，cP＜0.05；与100 μmol/L当归多糖组比较，dP＜0.05；与200 μmol/L当归多糖组比较，eP＜0.05。

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3.2 各组细胞活力比较 高糖组细胞活力低于对照组（P<0.05），当归多糖组细胞活力高于高糖组（P<0.05），当归多糖+ML385组细胞活力低于当归多糖组（P<0.05）。（见表3）

表3 各组细胞活力比较 （±s）

表3 各组细胞活力比较 （±s）

注：与对照组比较，aP<0.05；与高糖组比较，bP＜0.05；与当归多糖组比较，cP＜0.05。

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3.3 各组细胞凋亡情况比较 高糖组细胞凋亡率高于对照组（P<0.05），当归多糖组细胞凋亡率低于高糖组（P<0.05），当归多糖+ML385组细胞凋亡率高于当归多糖组（P<0.05）。（见表4、图1）

图1 流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况

表4 各组细胞凋亡率比较 （±s）

表4 各组细胞凋亡率比较 （±s）

注：与对照组比较，aP<0.05；与高糖组比较，bP＜0.05；与当归多糖组比较，cP＜0.05。

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3.4 各组细胞氧化应激水平比较 高糖组细胞MDA含量高于对照组，GSH-Px、SOD含量低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）；当归多糖组细胞MDA含量低于高糖组，GSH-Px、SOD含量高于高糖组，差异均有统计学意义（P<0.05）；当归多糖+ML385组细胞MDA含量高于当归多糖组，GSH-Px、SOD含量低于当归多糖组，差异均有统计学意义（P<0.05）。（见表5）

表5 各组细胞氧化应激水平比较 （±s）

表5 各组细胞氧化应激水平比较 （±s）

注：与对照组比较，aP<0.05；与高糖组比较，bP＜0.05；与当归多糖组比较，cP＜0.05。

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3.5 各组细胞Akt mRNA、GSK-3β mRNA、Nrf2 mRNA相对表达量比较 高糖组细胞Akt mRNA、GSK-3β mRNA相对表达量高于对照组，Nrf2 mRNA相对表达量低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）；当归多糖组细胞Akt mRNA、GSK-3β mRNA相对表达量低于高糖组，Nrf2 mRNA相对表达量高于高糖组，差异均有统计学意义（P<0.05）；当归多糖+ML385组细胞Akt mRNA、GSK-3β mRNA相对表达量高于当归多糖组，Nrf2 mRNA相对表达量低于当归多糖组，差异均有统计学意义（P<0.05）。（见表6）

表6 各组细胞Akt mRNA、GSK-3β mRNA、Nrf2 mRNA相对表达量比较 （±s）

表6 各组细胞Akt mRNA、GSK-3β mRNA、Nrf2 mRNA相对表达量比较 （±s）

注：与对照组比较，aP<0.05；与高糖组比较，bP＜0.05；与当归多糖组比较，cP＜0.05。

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3.6 各组细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白相对表达量比较 高糖组细胞Bcl-2蛋白相对表达量低于对照组，Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白相对表达量高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）；当归多糖组细胞Bcl-2蛋白相对表达量高于高糖组，Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白相对表达量低于高糖组，差异均有统计学意义（P<0.05）；当归多糖+ML385组细胞Bcl-2蛋白相对表达量低于当归多糖组，Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白相对表达量高于当归多糖组，差异均有统计学意义（P<0.05）。（见表7、图2）

图2 各组细胞凋亡蛋白表达Western blotting 图

表7 各组细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9 蛋白相对表达量比较 （±s）

表7 各组细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9 蛋白相对表达量比较 （±s）

注：与对照组比较，aP<0.05；与高糖组比较，bP＜0.05；与当归多糖组比较，cP＜0.05。

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4 讨论

DR的发病和进展过程是多细胞因子参与的过程；主要原因为神经细胞长期处于高糖微环境中，造成视网膜氧化应激严重，导致视网膜神经节细胞凋亡；其中信号传导代谢酶、氧化应激因子、离子通道和炎症因子均发挥着重要调控作用[10-11]。近年来，研究表明，在DR的发病过程中，RGCs凋亡的主要因素可通过影响细胞的氧化应激水平，调控RGCs的细胞凋亡信号通路控制凋亡相关基因表达，从而导致RGCs凋亡[12]。因此，研究RGCs的细胞凋亡机制，寻找作用靶点对DR临床治疗有着重大意义。

当归多糖为中药当归的水溶提取物，可以改善机体造血功能，提高免疫力，具有较强的抗氧化作用[13-15]。研究表明，当归多糖对视网膜缺血-再灌注的大鼠神经节细胞具有保护作用，能大幅度缩短视力恢复时间，提示当归多糖对RGCs具有保护作用[16-17]。因此，本研究通过采用不同浓度当归多糖处理体外培养的RGC-5细胞，探讨当归多糖对高糖诱导的RGC-5细胞凋亡的影响。结果显示，在MTT实验中，采用不同浓度的当归多糖（0、25、50、100、200、400 μmol/L）作用于RGC-5细胞后，各组细胞存活率均明显降低，且呈现浓度依赖性。当归多糖作用于RGC-5细胞24 h的IC50约为100 μmol/L，所以后续实验当归多糖给药浓度为100 μmol/L。当归多糖组细胞活力明显高于高糖组，且细胞凋亡率低于高糖组，而当归多糖+ML385组细胞活力低于当归多糖组，且细胞凋亡率高于当归多糖组。表明当归多糖能抑制高糖诱导的RGC-5细胞凋亡，对RGC-5细胞具有保护作用，而当归多糖对RGC-5细胞的保护作用会受到Nrf2通路抑制剂的影响。

当归多糖组细胞MDA含量低于高糖组，GSH-Px、SOD含量高于高糖组，而当归多糖+ML385组细胞MDA含量高于当归多糖组，GSH-Px、SOD含量低于当归多糖组。表明当归多糖能抑制RGC-5细胞内氧化应激水平，对RGC-5细胞具有保护作用，而当归多糖对RGC-5细胞的保护作用会受到Nrf2通路抑制剂的影响。

Akt/GSK-3β信号通路在细胞的生长、增殖和分化过程中进行调控，是影响RGCs凋亡的典型信号通路[18-19]。当RGC-5细胞受到高糖环境的刺激时，异常的氧化应激水平可激活细胞质中静息状态的Akt[20]。Akt激活后与GSK-3β区域中相应受体结合，并从细胞膜转移至细胞核中，由磷酸化作用激活或抑制其下游抗氧化元件Nrf2和凋亡/抑凋亡蛋白的表达水平（包括抑凋亡蛋白Bcl-2和凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-9），从而影响细胞的氧化应激反应与凋亡进程[21-22]。此外，Akt/GSK-3β信号通路还可参与细胞生命活动，如葡萄糖的转运与蛋白质的合成[23]。在糖尿病的进一步发展过程中，持续的高糖环境会活化Akt/GSK-3β信号通路，进而引起多种细胞因子的合成与释放，导致DR进一步恶化[24-25]。本研究结果表明，当归多糖组Nrf2 mRNA相对表达量高于高糖组，Akt mRNA、GSK-3β mRNA相对表达量均低于高糖组；当归多糖组Bcl-2蛋白相对表达量高于高糖组，Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白相对表达量均低于高糖组。当归多糖+ML385组Nrf2 mRNA相对表达量低于当归多糖组，Akt mRNA、GSK-3β mRNA相对表达量均高于当归多糖组；当归多糖+ML385组Bcl-2蛋白相对表达量低于当归多糖组，Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白相对表达量均高于当归多糖组。表明当归多糖能抑制高糖诱导的RGC-5细胞凋亡，对RGC-5细胞具有保护作用，然而在给予了Nrf2通路抑制剂后，当归多糖的抑凋亡作用受到阻滞，表明当归多糖对RGC-5细胞的保护作用会受到Nrf2通路抑制剂的影响。

综上所述，当归多糖对高糖诱导的RGC-5细胞凋亡有一定的抑制作用，能降低细胞内氧化应激水平，可能机制为阻滞Akt/GSK-3β通路，提高细胞内抗氧化Nrf2表达水平。