安神定志方对阿尔茨海默病细胞模型miR-103a-3p及Tau蛋白磷酸化的影响

王欣波 ，齐明明 ，邵音 ，赵宇 ，聂双莲 ，朴勇洙

1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种病因尚不明确的中枢神经系统退行性疾病，临床以认知功能降低与进行性记忆力减退为主要表现。作为临床痴呆的常见诱因，AD以异常磷酸化的Tau蛋白聚集形成的神经原纤维缠结和含β淀粉样蛋白（Aβ）的老年斑块为主要病理特征，目前尚无特效疗法能阻止或逆转AD 进展[1]，给家庭和社会带来沉重的经济负担[2-3]。目前全球约有5 000万AD患者，预计到21世纪中叶罹患AD的人数将升至1.52亿，我国目前约有1 000万AD患者。

miRNA是一类核苷酸内源性非编码RNA，具有高保守性和组织特异性，通过Aβ代谢、氧化应激反应、神经炎症、Tau蛋白磷酸化和胆固醇代谢等生理过程参与AD发生发展[4]。课题组前期研究发现，安神定志方能抑制海马组织miR-103a-3p/BDNF通路，参与Tau蛋白磷酸化的调控，发挥改善AD大鼠学习记忆能力的作用[5]。本研究通过体外实验观察安神定志方对Aβ诱导的大鼠PC12 细胞miR-103a-3p/BDNF/TrkB 通路相关分子表达的影响，进一步阐明安神定志方治疗AD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与细胞

清洁级雄性SD大鼠20只，8周龄，体质量（200±5）g，购于黑龙江中医药大学动物实验中心，动物许可证号SCXK（黑）2015-003。饲养于黑龙江中医药大学中西医结合实验室动物房，温度22.5～24.5 ℃，相对湿度44%～53%，光照时间12 h/d，自由摄食饮水。大鼠PC12细胞株购于中国科学院上海生科院细胞资源中心。

1.2 药物及制备

安神定志方（党参15 g，茯神15 g，茯苓15 g，龙齿25 g，石菖蒲5 g，远志5 g），饮片购自黑龙江中医药大学附属第一医院中药房。将饮片置于圆底烧瓶中，加清水浸泡，文火煎煮2次后合并药液，过滤后将药液浓缩至原药材浓度为1 g/mL，即得安神定志方水煎剂。

1.3 主要试剂与仪器

Aβ25-35（货号A4559），美国Sigma公司；胎牛血清（货号10099141C）、DMEM 培养基（货号11965084），美国Thermo Fisher 公司；MTT（货号C0009S）、Annexin V-FITC 试剂盒（货号C1062S）、Tau 抗体（货号AF1249）、p-TauSer396抗体（货号AF2368）、脑源性神经营养因子（BDNF）抗体（货号AF1423）、HRP标记二抗（货号A0208）、Lipo6000转染试剂（货号C0526），上海碧云天；酪氨酸激酶受体B（TrkB）抗体（货号ab187041）、p-TrkB抗体（货号ab229908）、β-actin 抗体（货号ab6276），英国Abcam公司；miR-103a-3p模拟剂，上海艾博思生物科技有限公司合成；TaqMan miRNA反转录试剂盒（货号4366596）、定量检测试剂盒（货号4427975），美国ABI公司；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（货号E-BCK046-M）、丙二醛（MDA）试剂盒（货号E-BCK025-S），武汉伊莱瑞特；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（货号MM-0386R2），江苏酶免；谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒（货号A005-1-1），南京建成。倒置相差显微镜（型号XZ-10），广州明美光电技术有限公司；流式细胞仪（型号Attune NxT）、实时荧光定量PCR仪（型号ABI7500），美国Thermo Fisher公司；电泳仪（型号164-5052）、凝胶成像仪（型号GelDoc），美国伯乐公司；全自动多功能酶标仪（型号DP-9602G），北京亚欧德鹏科技有限公司。

1.4 含药血清制备

20只大鼠随机分为空白组和安神定志方组，每组10只。按人与动物等效剂量换算给药剂量，安神定志方组予安神定志方水煎剂8 g/kg灌胃，空白组予等体积生理盐水灌胃，每日1次，连续7 d。末次灌胃24 h后，以1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，3 000 r/min 离心10 min，分离血清，水浴灭活，0.22 μm滤膜过滤，即得空白血清和含药血清，置于-80 ℃冰箱保存。

1.5 分组、造模及干预

PC12细胞以DMEM完全培养基（含10%胎牛血清、1%双抗）于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞稳定传代2～3代后进行实验。

取对数期PC12细胞，以1×104个/孔接种于96孔板，转染前更换为Opti-MEM 减血清培养基，通过Lipo6000 将miR-103a-3p 模拟剂转染至50%融合的PC12细胞，置于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育，6 h后更换为DMEM完全培养基继续培养24 h，收集细胞进行后续实验。

设置空白组、模型组、安神定志方组、过表达组和安神定志方+过表达组（联合组），每组3个复孔。PC12细胞以106个/孔接种于6孔板，过表达组和联合组接种转染miR-103a-3p模拟剂的细胞。除空白组不予处理外，其余各组采用20 μmol/L Aβ25-35处理24 h建立AD细胞模型[6]。24 h后，空白组、模型组和过表达组更换为10%空白血清培养基，安神定志方组和联合组更换为10%含药血清培养基，置培养箱中继续培养。

1.6 指标检测

1.6.1 细胞活力

培养24、48、72 h 向各孔加入5 mg/mL MTT 溶液，继续孵育4 h，酶标仪波长570 nm处检测各孔吸光度，即为细胞活力。

1.6.2 细胞凋亡

培养48 h 后收集细胞，1 000 r/min 离心10 min，按106个/mL进行重悬，加入Annexin V-FITC和碘化丙啶各5 μL，暗室孵育15 min，通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡水平，计算凋亡率。

1.6.3 氧化应激相关指标检测

培养48 h 后收集细胞上清液，参照试剂盒说明书检测上清液LDH 活性。细胞经反复冻融进行裂解，3 500 r/min 离心15 min，收集上清液，BCA 法进行蛋白定量，参照试剂盒说明书检测MDA含量及SOD、GSH-Px活性。

1.6.4 RT-qPCR检测

培养48 h后收集细胞，采用TRIzol试剂盒提取总RNA，TaqMan miRNA 反转录试剂盒合成cDNA，TaqMan miRNA定量试剂盒进行RT-qPCR。反应条件：95 °C、60 s；95 °C、15 s，60° C、15 s，72 °C、45 s，4 °C、1 min，共40个循环。以U6为内参，2-ΔΔCt法计算miR-103a-3p相对表达量。引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.6.5 Western blot检测

培养48 h后收集细胞，加入RIPA裂解液提取蛋白，4 ℃、1 000 r/min离心10 min，采用BCA法测定蛋白浓度。上样20 μg，SDS-PAGE 分离蛋白，转至PVDF膜，用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入BDNF一抗（1∶1 000）、p-TrkB一抗（1∶1 000）、TrkB一抗（1∶5 000）、p-Tau一抗（1∶500）、Tau一抗（1∶1 000）、β-actin一抗（1∶5 000），4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次，加HRP标记二抗（1∶1 000），37 ℃孵育40 min。采用ECL法对膜进行显影，凝胶成像系统成像后使用Quantity One 3.0软件分析。以β-actin为内参，计算目的蛋白相对表达量。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 安神定志方对PC12细胞活力的影响

空白组细胞形态正常，呈多角形或梭形，细胞贴壁成簇生长，突起较长且相互交织呈网状分布；模型组细胞缩小变圆，呈脱壁聚集状，部分细胞漂浮、折光性下降，突起变短甚至消失；安神定志方组及联合组细胞在细胞生长与交织成网方面与模型组接近，在细胞数量方面较模型组减少、突起较模型组缩短、连接较模型组紊乱；过表达组PC12细胞损伤严重，细胞皱缩聚集、折光性骤降、突起减少。见图1。

图1 各组PC12细胞形态（×100）

与空白组比较，模型组PC12细胞各时点细胞活力明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，安神定志方组和联合组PC12细胞各时点细胞活力明显升高（P＜0.05，P＜0.01），过表达组各时点细胞活力明显降低（P＜0.01）；与过表达组比较，联合组PC12细胞各时点细胞活力明显升高（P＜0.01）。安神定志方组培养48 h时细胞活力升高最明显，因此选择培养48 h进行后续实验。见表2。

表2 各组PC12细胞不同时点细胞活力比较（±s）

表2 各组PC12细胞不同时点细胞活力比较（±s）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与过表达组比较，●●P＜0.01

组别空白组模型组安神定志方组过表达组联合组72 h 0.69±0.06 0.41±0.03**0.51±0.04##0.34±0.04##0.46±0.06#●●n33333 24 h 0.45±0.03 0.31±0.04**0.41±0.04##0.25±0.03##0.37±0.03#●●48 h 0.57±0.04 0.36±0.05**0.52±0.07##0.28±0.03##0.43±0.03#●●

2.2 安神定志方对PC12细胞凋亡的影响

与空白组比较，模型组细胞凋亡率明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，安神定志方组和联合组细胞凋亡率明显降低（P＜0.01），过表达组细胞凋亡率明显升高（P＜0.01）；与过表达组比较，联合组细胞凋亡率明显降低（P＜0.01）。见表3、图2。

图2 各组PC12细胞凋亡检测流式图

表3 各组PC12细胞凋亡率比较（±s，%）

表3 各组PC12细胞凋亡率比较（±s，%）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与过表达组比较，●●P＜0.01

凋亡率10.39±1.17 22.85±1.97**12.67±1.19##30.82±2.31##17.48±1.23#●●组别空白组模型组安神定志方组过表达组联合组n33333

2.3 安神定志方对PC12细胞氧化应激相关指标的影响

与空白组比较，模型组细胞LDH活性和MDA含量增加，SOD和GSH-Px活性降低，差异均有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，安神定志方组和联合组细胞LDH活性和MDA含量减少，SOD和GSH-Px活性增加，过表达组细胞LDH活性和MDA含量增加，SOD和GSH-Px活性降低，差异均有统计学意义（P＜0.01）；与过表达组比较，联合组细胞LDH 活性和MDA含量减少，SOD和GSH-Px活性增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表4。

表4 各组PC12细胞LDH、SOD、GSH-Px活性及MDA含量比较（±s）

表4 各组PC12细胞LDH、SOD、GSH-Px活性及MDA含量比较（±s）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与过表达组比较，●●P＜0.01

GSH-Px/（μmol/L）26.45±1.73 8.58±1.12**15.12±2.36##4.13±0.89##10.34±1.29#●●组别空白组模型组安神定志方组过表达组联合组n33333 LDH/（U/L）346.12±25.12 832.98±41.19**391.45±24.78##943.48±42.23##687.26±36.57##●●SOD/（U/mL）198.47±14.36 48.32± 4.01**173.21±16.12##22.15± 3.89##64.36± 4.71#●●MDA/（mmol/mL）265.24±19.12 587.18±31.13**276.35±19.89##734.67±32.18##513.61±29.27#●●

2.4 安神定志方对PC12 细胞miR-103a-3p mRNA 表达的影响

与空白组比较，模型组细胞miR-103a-3p mRNA表达明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，安神定志方组和联合组细胞miR-103a-3p mRNA 表达明显降低（P＜0.01），过表达组miR-103a-3p mRNA表达明显升高（P＜0.01）；与过表达组比较，联合组细胞miR-103a-3p mRNA表达明显降低（P＜0.01）。见表5。

表5 各组PC12细胞miR-103a-3p mRNA表达比较（±s，相对表达量）

表5 各组PC12细胞miR-103a-3p mRNA表达比较（±s，相对表达量）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01；与过表达组比较，●●P＜0.01

miR-103a-3p 1.00±0.03 2.92±0.19**1.78±0.12##3.91±0.21##2.13±0.14##●●组别空白组模型组安神定志方组过表达组联合组n33333

2.5 安神定志方对PC12 细胞Tau、脑源性神经因子、酪氨酸激酶受体B蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组PC12细胞p-Tau蛋白表达明显升高，BDNF、p-TrkB蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，安神定志方组和联合组PC12细胞p-Tau蛋白表达明显降低，BDNF、p-TrkB蛋白表达明显升高，过表达组PC12细胞p-Tau蛋白表达明显升高，BDNF、p-TrkB蛋白表达明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.01）；与过表达组比较，联合组PC12 细胞p-Tau 蛋白表达明显降低，BDNF、p-TrkB蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。各组细胞Tau、TrkB蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3、表6。

图3 各组PC12细胞Tau、BDNF、TrkB蛋白免疫印迹

表6 各组PC12细胞Tau、BDNF、TrkB蛋白表达比较（±s）

表6 各组PC12细胞Tau、BDNF、TrkB蛋白表达比较（±s）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01；与过表达组比较，●●P＜0.01

TrkB 0.84±0.06 0.82±0.05 0.83±0.03 0.82±0.07 0.81±0.06组别空白组模型组安神定志方组过表达组联合组n33333 p-Tau 0.11±0.02 0.49±0.05**0.18±0.03##0.73±0.09##0.31±0.04##●●Tau 0.98±0.09 1.04±0.12 1.01±0.09 1.05±0.11 1.03±0.11 BDNF 1.07±0.10 0.51±0.15**1.03±0.09##0.39±0.06##0.62±0.13##●●p-TrkB 0.94±0.11 0.37±0.06**0.61±0.07##0.21±0.03##0.51±0.08##●●

3 讨论

AD属中医学“痴呆”范畴，为本虚标实之证，以虚为主，日久导致脏腑衰惫，或每与痰瘀兼杂，治疗上应重视痰瘀与AD的关系[7]。安神定志方出自《医学心悟》，具有安神益智、豁痰开窍功效。方中党参与远志安神益智，为君药；臣以茯苓、茯神健脾宁心安神；佐以石菖蒲、龙齿豁痰开窍、镇惊安神。研究发现，本方药物及其有效成分可通过多靶点、多通路发挥治疗AD作用[8-10]。本研究结果表明，安神定志方可以改善Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤，提高细胞活力，抑制其凋亡水平。

氧化应激反应在AD生理病理过程中扮演重要角色，可加剧神经元损害，并通过诱导神经元细胞周期紊乱，导致神经退行性病变，进而引起患者认知能力改变。MDA作为脂质过氧化的最终产物，可抵抗活性氧（ROS）诱导的氧化应激，可以间接提示细胞过氧化损伤程度。过度的氧化应激引起ROS大量释放，从而增加MDA含量，进一步导致神经鞘膜完整性破坏。有研究显示，机体氧化应激损伤程度与LDH活性呈正相关，而氧化应激能导致细胞膜损伤，增加细胞膜通透性，促使LDH释放到细胞外[11]。SOD能减轻氧化应激对神经元造成的损伤，在不饱和脂质氧化降解过程中，SOD能够抑制ROS诱导的MDA产生，抑制神经毒性[12]。研究发现，机体内GSH-Px等抗氧化酶减少可导致体内自由基大量生成，加强过氧化反应，破坏组织和细胞，降低组织功能，造成机体衰老[13]。本研究结果发现，安神定志方可显著降低PC12细胞LDH活性和MDA含量，增加SOD和GSH-Px活性，表明安神定志方可抑制Aβ25-35诱导的氧化应激反应。

BDNF是广泛分布于大脑皮层和海马组织的碱性蛋白，通过调控神经元突触形态与功能影响学习能力。作为神经保护因子，BDNF对神经元生长、分化、成熟和可塑性的维持具有重要作用[13]。此外，BDNF可通过与细胞膜上TrkB蛋白特异性结合，调控神经递质的合成及释放[14-15]。Tau蛋白是一种微管相关蛋白，主要分布于神经元的轴突部分，其磷酸化水平与脑组织神经原纤维的缠结程度密切相关。Aβ通过与Tau蛋白结合形成可溶性的稳定复合物，进一步促进神经原纤维缠结及突触功能障碍，从而诱导神经元细胞死亡[16]。Tau蛋白异常磷酸化是AD的特征性病理表现，在众多的Tau蛋白磷酸化位点中，以丝氨酸（占53%）与苏氨酸（占41%）位点磷酸化为主[17]。据报道，Thr231、Thr181和Ser396位点与AD密切相关[18-19]。本研究结果表明，安神定志方可显著下调PC12细胞miR-103a-3p mRNA 表达，与动物实验结果[5]一致。在此基础上，Western blot结果证实，安神定志方能显著上调BDNF和p-TrkB蛋白表达，而miR-103a-3p模拟剂能显著下调PC12细胞BDNF及p-TrkB蛋白水平。此外，本实验结果还发现，miR-103a-3p模拟剂能上调Ser396位点p-Tau蛋白表达，而安神定志方能部分拮抗miR-103a-3p对Tau蛋白磷酸化的促进作用。

综上所述，安神定志方可能通过抑制PC12细胞miR-103a-3p表达激活BDNF/TrkB信号通路，从而抑制Tau蛋白磷酸化，对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤发挥保护作用。