三叶青质量控制方法研究进展

2023-06-13伍婷李振斌杜家会李茂凯姚天月崔玉发

中国民族民间医药·下半月 2023年5期

伍婷李振斌杜家会李茂凯姚天月崔玉发

【摘要】目的：综述三叶青质量控制研究进展，为进一步完善三叶青药材质量控制提供参考。方法：查阅目前关于三叶青质量评价的文献，并对其进行整理和归纳。结果：目前关于三叶青质量控制研究主要涉及性状鉴定、显微鉴别、活性化学成分的含量测定及指纹图谱研究。结论：虽然已有关于三叶青真伪辨别和质量好坏的评价研究，但目前质量优劣的评价仅凭一种或几种化学成分的含量测定，不能真正控制其质量，对三叶青质量评价进行综述，为进一步完善三叶青质量控制奠定基础，促进三叶青药用资源标准化、合理化的开发和利用。

【关键词】三叶青；质量控制；黄酮类；多糖；酚类

【中图分类号】R282.6【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2023）09-0049-06

Research Progress on Quality Control Methods of Tetrastigma HemsleyanumWU TingLI ZhenbinDU JiahuiLI MaokaiYAO TianyueCUI Yufa

Southwest Vocational and Technical College for Nationalities，Xingyi 562400，ChinaAbstract：Objective By summarizing the research progress on quality control of Tetrastigma hemsleyanum Diels，it provides reference for the quality control of Tetrastigma hemsleyanum.Methods By referring to the current literature on quality evaluation，it sorted out the research progress of quality control of Tetrastigma hemsleyanum.Results At present，the studies on quality control of Tetrastigma hemsleyanum mainly include character identification，microscopic identification，content determination of active components and fingerprint analysis. Conclusion There have been some studies on the identification and quality evaluation of etrastigma hemsleyanum，but the quality evaluation depends only on the content determination of one or several chemical components，which can not really control its quality.This paper summarizes the quality control of Tetrastigma hemsleyanum，which lays a foundation for further improving the quality control of Tetrastigma hemsleyanum，and promotes the standardization and rationalization of the development and utilization of medicinal resources of Tetrastigma hemsleyanum.

Keywords：Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg；Quality Control；Flavonoids；Polysaccharide；Phenols

三叶青（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg）又名金线吊葫芦、蛇附子、石老鼠、丝线吊金钟、石猴子等，为葡萄科三叶崖爬藤属植物，多年生常绿草质藤本［1］。主要分布于浙江、福建、江西、广东、广西、四川、湖南、四川、云南和贵州等地，常生长在荫蔽的山谷、林间等腐殖质较高的地方［2-3］。三葉青药用价值很高，全株可入药，以地下块根和果实药用效果较好，具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛等功效，在民间常用于治疗小儿高热惊风、百日咳、疮痈痰核、毒蛇咬伤、急慢性肝炎和黄疸等疾病，素有“植物抗生素”的美誉［4-7］。三叶青的化学成分十分丰富，目前分离到成分主要为黄酮类、多糖类、酚酸类、萜类及甾体类、挥发油类等，黄酮、酚酸和多糖为其主要的活性成分［8］。现代药理学研究［9-14］表明，三叶青具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗肝损伤、调节免疫等药理活性，被广泛应用于药品和保健品中，如华佗风痛宝、金丝地甲胶囊、结石康胶囊等，此外，三叶青还用于中西医结合治疗新冠肺炎的方剂中［15］。目前药用三叶青主要来自于野生，而自然条件生长缓慢，加上人们过度采摘，野生三叶青已无法满足人们的需求甚至濒临灭绝［16］。虽然三叶青的用途十分广泛，药用价值很高，但是目前2020版《中国药典》未收载三叶青。现对目前三叶青质量控制研究现状进行概括，为进一步完善三叶青质量控制奠定基础，从而促进三叶青药用资源规范化、标准化和合理化的开发和利用。

1性状鉴别

三叶青块根呈纺锤形、软圆形、葫芦形或椭圆形，单枚或数枚连呈珠状一般长1～7 cm，直径0.3～4.2 cm。表面褐色、棕色，多数较光滑，或有皱纹，少数呈皮孔状的小瘤状突起，有时还有凹陷，其内残留褐色细根。质硬且脆，断面平坦而粗糙，类白色或灰棕色，可见棕色形成层环，气辛、味甘［17-18］。三叶青分布较广，因产地不同，块根大小上略有差异［19］。

2显微鉴别

三叶青药用价值十分广泛，尤其在抗肿瘤方面有很好的效果，导致市场需求量大，价格居高不下，很多不良商家将外观相似的乌头类植物子跟的生品混在三叶青块根饮片谋取利益，尤其打成药粉后更加难以鉴别，而显微鉴别是药材粉末鉴别常用的手段之一。三叶青块根粉末一般微黄至红棕色，木栓细胞深黄棕色；淀粉粒极多，以单粒为主，椭圆形，类三角形，类圆形；有具缘纹孔导管；草酸钙簇晶和针晶存在于黏液细胞或散开［20］。如图1所示。

3三叶青薄层色谱研究

崔伟亮等［20］建立了薄层色谱法鉴别三叶青的方法。三叶青塊根粉末用乙醇加热回流充分提取，过滤，滤液蒸馏去除乙醇，用石油醚洗涤2次后用乙酸乙酯提取，合并提取液，蒸干后用乙醇溶解配成供试液。以芦丁为对照品，乙酸乙酯-甲酸-水（8∶1∶1）作为展开剂，三氯化铝（AlCl3）试液作为显色试剂，置于紫外灯365 nm处，供试样品和对照品薄层色谱均在相应位置显示相同颜色的荧光斑点。周煜恒等［21］以荭草苷、异荭草苷、牡荆素等黄酮成分作为对照品，展开剂为乙酸乙酯-甲酸-甲苯-水（8∶1∶1∶1），3% 的AlCl3溶液作为显色剂，于紫外灯365 nm下检视，发现在薄层色谱中三叶青片剂供试品与对照品在相应位置上呈现相同颜色的斑点。薄层色谱分离效果较好、斑点清晰，可用于三叶青的定性鉴别。

4比色法测定三叶青总黄酮含量

黄酮及其苷类是三叶青的重要的活性成分，其块根、茎、叶中均含有丰富的黄酮类活性成分，具有保肝抗炎、抗肿瘤、调节免疫等药理活性，是目前三叶青中研究较为系统深入的一类化合物［22-24］。林婧等［25］建立了比色法测定三叶青总黄酮含量的方法，三叶青块根经粉碎后加入适量甲醇，超声提取约30 min后放冷至室温，过滤后即制成三叶青甲醇提取液，依次加入5%亚硝酸钠溶液、10%硝酸铝溶液、10%氢氧化钠溶液，以芦丁为对照品，于500 nm处测定吸光度。该方法准确、简便、快速、重现性好，适用于三叶青药材总黄酮的含量测定。阮明颖［26］用该方法测定不同产地三叶青茎叶及块根中总黄酮含量，发现总黄酮含量在不同产地、相同产地不同样品间均存在差异，茎叶部分总黄酮含量以浙江丽水产区最高，可达（46.9±3.8）mg/g，云南、贵州、重庆等地区含量较低；块根部分总黄酮含量以广西田林产区的最高，达（40.1±3.9）mg/g，同样的云南、贵州、重庆等地区含量偏低。

5高效液相色谱法测定三叶青黄酮

何晓丽等［27］建立了以芦丁、异槲皮苷等6种指标成分，同时测定不同产地三叶青块根中这6 种黄酮含量的HPLC法，发现不同产地的三叶青样品中6中黄酮类成分在含量上存在差异。于虹敏等［28］采用超快速液相色谱-光电二极管阵列检测器法（UFLC-DAD），同时测定三叶青药材块根中原花青素B1和儿茶素的含量，用于浙江、福建不同产地三叶青的质量评价。三叶青黄酮类有效成分的研究多集中于块根部位，且多为非碳苷类黄酮，而邓思珊等［29］采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）对三叶青叶化学成分进行鉴定，检测到碳苷黄酮成分荭草素类和牡荆素类，运用HPLC进行含量测定发现不同产地三叶青叶子中碳苷组成与含量差异较大，甚至有的样品中检测不到碳苷类黄酮。许文等［30］建立了10种三叶青黄酮类成分HPLC含量测定方法，并测定了30批不同产地野生或人工栽培的三叶青块根中10种不同黄酮的含量，三叶青药材来源及测定结果见表1。高效液相色谱法测定黄酮含量快速简便、准确可行、重现性好，可作为中药材三叶青质量评价的有效方法。

6三叶青HPLC指纹图谱研究

中药组分是一个复杂体系，HPLC指纹图谱能较为全面反映药材中化学成分的种类及含量，有利于中药质量的整体评价，对于提高中药质量具有重要意义。程林等［31］应用HPLC对三叶青块根进行色谱指纹图谱研究，以β－谷甾醇作为参照峰，标定了7个共有特征峰，通过对比10批不同三叶青样品色谱图进行相似度分析，相似度在0.823 ～ 0.928之间，推测造成差异的原因可能是产地、气候、土壤、种植方式等导致在化学成分方面存在差异。范世明等［32］采用超高效液相建立了三叶青叶指纹图谱研究，以牡荆苷作为参照峰，共标定了15个共有峰，其中12个共有峰与标品进行比对鉴定，并通过相似度分析评价41批三叶青样品的相似度均达到0.9以上，通过对比文献发现三叶青叶与块根的指纹图谱存在较大差异，且三叶青叶指纹图谱相似度高于块根。张晓芹等［33］通过HPLC建立的三叶青饮片指纹图谱共有模式，标定了7个共有峰，并指定了其中5个成分，对比指纹图谱10批样品在化学成分上一致，但在含量上存在差异（如图2所示），进行相似度分析发现10批不同样品中，除2个批号，其余批号样品与对照图谱相似度为0.941～0.973。李士敏等［34］采用 HPLC 指纹图谱结合化学识别模式，对来自浙江、云南和贵州3个省份不同地区72批三叶青采集HPLC指纹图谱，共标定18个共有峰，利用随机森林算法结合指纹图谱有效地鉴别和区分不同地区的三叶青，阐明样品间的细微差别，为不同产区三叶青质量评价提供参考。HPLC指纹图谱方法操作简单、重复性好，为三叶青整体性质量评价提供可靠依据。

7三叶青总多糖含量测定

多糖是一类非常重要而复杂的化合物，对于机体的调控具有重要生物学意义。随着对三叶青研究的不断深入，发现从三叶青中提取的多糖具有很好的抗氧化、抗肿瘤和抗肝损伤等生物活性［12，35-37］。阮明颖［26］采用分光光度法分别测定其块根及茎叶部位的多糖含量，样品经粉碎后，置于索氏提取器中用50%的乙醇回流提取，提取液经4000 rpm离心10 min后，弃去上清液，待乙醇挥干后用水提取即得多糖提取液，提取液用Sevage试剂脱蛋白后，以葡萄糖作为标准品，采用苯酚—硫酸法在葡萄糖标准品溶液不同浓度下，于最大吸收波长489 nm下分别测定吸光度并绘制标准曲线，根据标准曲线计算供试样品中多糖的含量。发现三叶青多糖含量因产地不同或部位不同存在显著的差异，所测样品中，对于茎叶部分，浙江庆元多糖含量最高，可达（49.5±5.1）mg/g，而湖北、贵州、云南和重庆等地区的多糖含量普遍低于其它地区，平均值仅为 20.3 mg/g；块根部分，以浙江丽水最高，可达（63.2±5.8）mg/g，同样湖北、贵州、云南和重庆等地区的多糖含量普遍低于其它地区，平均值仅为29.2 mg/g。

8三葉青总酚含量的测定

三叶青中分离到的酚酸类化合物主要是以苯甲酸和桂皮酸为基本母核，酚酸类化合物因其独特的化学结构在抗炎、降血脂、抗氧化等方面具有显著的活性，尤其在抗氧化方面甚至优于维生素C，是天然的抗氧剂［38］。陈翔等［39］采用分光光度法测定三叶青块根的多酚含量，三叶青块根粉末于75%乙醇溶剂中经超声提取，过滤后所得滤液即为提取液，以没食子酸为标准品，在最大吸收波长765 nm下测定不同浓度没食子酸溶液的吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，根据标准曲线回归方程可计算三叶青样品中总多酚的含量。蒋梦丹等［40］也采用分光光度法测定三叶青总酚的含量，发现三叶青根须的总酚含量高于块根，根须上端的含量最高，以抗坏血酸为标准品，采用DPPH 法测定三叶青地下部分不同部位的抗氧化活性，发现上端根须的抗氧化活性最佳，可能与总酚含量有关。

9小结与展望

三叶青作为我国特有的珍稀药用植物，具有丰富的化学成分，药理作用显著，具有广阔的药用价值，本文主要综述了三叶青药材性状鉴定、显微鉴别、HPLC 指纹图谱研究、活性化学成分的含量测定等的质量控制方法，这些研究成果将为今后更好地应用三叶青发挥了重要作用。虽然三叶青质量控制研究取得了一定进展，但目前仍存在一些问题需进一步探索，首先，含量测定的化学成分主要集中在黄酮类、多糖类化合物，缺乏对其他类化学成分的含量测定研究；其次，对于同时测定不同活性类型化学成分含量进行全面质量控制研究甚少。因此，对于三叶青质量控制的研究需进一步深入，为促进三叶青药用资源规范化、标准化、合理化的开发和利用奠定基础。

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