基于网络药理学及分子对接技术探讨人参治疗胃癌的作用机制▲

卢 鑫 尹硕鑫 江水玉 李清梅 覃靖燊 张 涛 陈远能

(1 广西中医药大学研究生院,广西南宁市 530000;2 广西中医药大学附属瑞康医院消化内科,广西南宁市 530011)

胃癌是全球第五大常见癌症,也是第三大常见癌症死亡原因[1]。世界卫生组织2020年发布的数据显示,在中国癌症患者中,胃癌的总患病率和病死率均排名第三[2]。胃癌早期患者症状不明显,多数患者确诊时已是中晚期,给其家庭和社会带来沉重的负担[3]。中医认为,胃癌是由于饮食劳伤、情志内伤、瘀血内阻、热毒内蕴等多种因素综合作用而发病,病位在胃,病理因素主要有痰、瘀、毒。扶正培本是中医治病的基本原则。对于肿瘤患者,扶正培本是指通过扶助补益与调节肿瘤患者的阴阳气血,改善肿瘤患者“虚证”状态,从而达到防治肿瘤的目的[4]。人参享有“百草之王,百药之长”的美誉,在我国用药频率高[5],治疗的病种范围广,是我国珍贵的中药之一。人参为大补元气、扶正补益之药,对胃癌晚期患者大有裨益。有研究显示,人参含有的人参皂苷等化合物对胃癌细胞的增殖有抑制作用[6-7]。还有研究显示,人参皂苷Rh2联合阿霉素能够提高人胃癌阿霉素耐药性细胞SGC7901的化疗敏感性,可通过阻滞细胞周期、促进细胞凋亡,进而抑制肿瘤细胞的增殖[8]。但人参防治胃癌的机制可能是多成分通过多靶点、多通路调控细胞周期、促进细胞凋亡。本研究运用网络药理学方法结合分子对接技术探讨人参治疗胃癌的作用机制,以期为传统中药人参在胃癌治疗中的临床应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 人参有效化学成分及其相应作用靶点的筛选 利用中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP;http://tcmspw.com/tcmsp.php)检索“人参”的化学成分,并设置药物相似性(drug-likeness,DL)≥0.18、口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥15%为有效化学成分的筛选标准。将符合条件的有效化学成分输入TCMSP,得到有效化学成分的相应作用靶点,剔除尚未明确相应作用靶点的有效化学成分。将限定物种设置为人类[9],再利用UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)将靶点名称转换为标准基因名,根据对应靶点数目由多到少、OB由高到低、DL由高到低将有效化学成分进行综合排序,以排名前5的有效化学成分作为人参主要有效化学成分。

1.2 胃癌相关靶点的筛选 以“gastric cancer”“gastric carcinoma”为关键词,分别在GeneCards®数据库(https://www.genecards.org/)、DRUGBANK数据库(https://go.drugbank.com/)、OMIM®数据库(https://www.omim.org/)检索胃癌相关靶点,检索时间为建库至2021年10月,以Relevance score>9为标准对GeneCards®数据库检索到的靶点进行进一步筛选,再将3个数据库得到的靶点导入Microsoft Excel表格中进行格式调整、标准基因名转换等标准化处理,删除重复的靶点,获得胃癌相关靶点,利用UniProt数据库将靶点名称转换为标准基因名。

1.3 “人参-成分-靶点”网络构建 将人参的有效化学成分及其相应作用靶点导入Cytoscape 3.7.2(https://cytoscape.org/download.html)中,并利用Network Analyzer插件的Merge功能绘制成“人参-成分-靶点”网络。运用Venny 2.1.0软件(http://www.bioinformatics.com.cn/)绘制韦恩图,从而获取人参有效化学成分作用靶点、胃癌相关靶点的共有靶点(即交集靶点)。

1.4 蛋白-蛋白相互作用网络的构建 将交集靶点上传至STRING 11.0数据库(https://string-db.org/),将置信度设置为>0.400,获取蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络,并保存为TSV格式文件。将该PPI网络导入Cytoscape 3.7.2进行可视化处理及网络拓扑学分析,根据介数中心性(betweenness centrality,BC)、接近中心性(closeness centrality,CC)、度值等拓扑参数筛选核心靶点,根据筛选结果构建核心靶点的PPI网络图。

1.5 功能富集分析与通路富集分析 为进一步探究人参治疗胃癌所涉及的生物过程、分子功能、细胞组分及信号通路,将交集靶点上传至Metascape平台(http://metascape.org/),限定物种设置为人类[9],进行基因本体论(Gene Ontology,GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。根据Benjamini-Hochberg校正法,设定P<0.01,根据-lgP值由大到小对富集分析结果进行排序,筛选出排名前20的生物过程、细胞组分、分子功能和信号通路。同时将人参有效化学成分、交集靶点、KEGG通路富集分析数据导入Cytoscape 3.7.2进行可视化处理,绘制“人参成分-交集靶点-通路”网络图。

1.6 分子对接 在TCMSP数据库下载人参的主要有效化学成分的结构并保存为MOL2格式;参考文献[10-13],选取与胃癌相关性较高的核心靶点,在PDB数据库(http://www.rcsb.org/)下载这些核心靶点的RCSB PDB格式数据文件;借助AutoDock Tools软件对主要有效化学成分和上述核心靶点的结构进行去水、加氢、计算电荷等处理,然后对两者进行分子对接分析。当结合能<0 kcal/mol时,配体即可自发与受体结合,当结合能<-4.0 kcal/mol时,说明受体与配体结合良好。

2 结 果

2.1 人参有效化学成分及其相应作用靶点的筛选结果 通过TCMSP数据库初步获取人参的化学成分共190个,以DL≥0.18、OB≥15%为标准筛选得到人参的有效化学成分58个,剔除未找到相应作用靶点的化学成分后获得人参有效化学成分共24个,根据靶点数目由多到少、OB由高到低、DL由高到低进行综合排序后得到的主要有效化学成分为人参皂苷Rh2、人参皂苷Rh4、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇,基本信息见表1。应用UniProt数据库将上述24个有效化学成分对应的279个靶点转化为标准基因名,剔除不符合条件的靶点,最终得到作用靶点117个。将人参有效化学成分及相应作用靶点导入Cytoscape 3.7.2软件进行可视化处理,得到“人参-成分-靶点”网络图,该网络由302条边、142个节点组成,见图1。

表1 人参有效化学成分基本信息表

图1 “人参-成分-靶点”网络

2.2 胃癌相关靶点的筛选结果 在GeneCards®数据库中获得胃癌相关靶点1 523个、在DRUGBANK数据库中获得胃癌相关靶点75个、在OMIM®数据库中获得胃癌相关靶点498个,将3个数据库获得的相关靶点去重后合并,共获得胃癌相关靶点1 921个。将1 921个胃癌相关靶点与117个人参有效化学成分的作用靶点取交集,共获得60个交集靶点,即人参治疗胃癌的相关靶点。见图2。

图2 人参有效化学成分作用靶点与胃癌相关靶点的韦恩图

2.3 人参治疗胃癌相关靶点的PPI网络 利用STRING 11.0及Cytoscape 3.7.2构建人参治疗胃癌相关靶点的PPI网络(见图3),此网络由591条边、60个节点构成,节点平均BC值为0.662,平均CC值为0.692,平均度值为19.7,根据BC值、CC值和度值筛选得出21个核心靶点,包括Jun B原癌基因(Jun B proto-oncogene JUN)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)1、信号转导和转录激活因子1(signal transducer and activator of transcription,STAT1)、基质金属蛋白酶9、Caspase-3、白细胞介素(interleukin,IL)-1β、过氧化物酶体增殖物激活受体、前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)8等,见表2。构建核心靶点的PPI网络,该网络由187条边、21个节点组成,见图4。

图3 人参治疗胃癌相关靶点的PPI网络

表2 拓扑学分析结果

图4 核心靶点的PPI网络

2.4 交集靶点的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析结果 将60个交集靶点上传至Matescape平台进行GO功能富集分析(P<0.01),得到1 211个生物过程、32种细胞组分、88种分子功能,以-lgP值排名前20的条目建立气泡图,见图5。其中,生物过程条目以凋亡信号通路、活性氧的代谢过程、对脂多糖的反应、炎症反应、上皮细胞迁移等为主;细胞组分条目以薄膜筏、膜微区、等离子膜筏、细胞质核周区、细胞外基质、外部封装结构等为主;分子功能条目以蛋白质结构域特异性结合、蛋白质同源二聚化活性、DNA结合转录因子结合、半胱氨酸型内肽酶活性、激酶结合等为主。

将60个交集靶点上传至Matescape平台进行KEGG通路富集分析(P<0.01),得到247条信号通路,-lgP值排名前20的主要信号通路包括癌症相关通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、乙型肝炎、IL-17信号通路、TNF信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/AKT信号通路、MAPK信号通路等,见表3和图5。将人参有效化学成分、交集靶点、KEGG通路富集分析数据导入Cytoscape 3.7.2软件处理得到“人参成分-交集靶点-通路”网络图,见图6。

表3 交集靶点的KEGG通路富集分析(排名前20)

图5 交集靶点的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析结果

图6 人参成分-交集靶点-通路网络图

2.5 分子对接结果 将人参5个主要有效化学成分,即人参皂苷Rh2、人参皂苷Rh4、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇,分别与核心靶点AKT1、JUN、TNF、PTGS2、Caspase-3、MAPK8进行分子对接验证。结果表明,人参皂苷Rh2、人参皂苷Rh4、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇均能与AKT1、JUN、TNF结合,其中人参皂苷Rh2、人参皂苷Rh4、β-谷甾醇、豆甾醇与AKT1结合良好,人参皂苷Rh4、山柰酚、β-谷甾醇与JUN结合良好,人参皂苷Rh4、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇与TNF结合良好,但上述化合物均与PTGS2、Caspase-3、MAPK8未能完成分子对接,结合性较差,见表4和图7。

表4 分子对接结果

图7 部分分子对接模式图

3 讨 论

人参作为大补元气的圣药,在临床上被广泛应用于各种疾病的治疗,特别是胃癌等肿瘤的晚期治疗。人参含有挥发油类、皂苷、蒽醌、黄酮、脂肪酸、游离氨基酸、微量元素等成分[14],其中人参皂苷不仅可以抑制癌细胞的增殖、侵袭和迁移,还可以通过促进细胞凋亡、阻滞细胞周期和诱导自噬,在多种癌症(如胃癌、乳腺癌、脑癌、肝癌和肺癌)中表现出抗癌和抗转移的特性[15]。研究显示,人参皂苷在胃癌的防治中发挥了重要作用[5-7]。因此,挖掘人参防治胃癌的作用机制对其药用价值的研究具有重要意义。

本研究通过TCMSP筛选得到人参的主要有效化学成分有人参皂苷Rh2、人参皂苷Rh4、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇等。其中,人参皂苷Rh2为人参皂苷类中抗肿瘤功效最好的单体成分[16],其具有抗过敏、调节免疫、改善心肌缺血、抗抑郁、抗肿瘤、提高化疗敏感性等多种功效[8,17]。研究表明,人参皂苷Rh4可以诱导结肠癌细胞凋亡,从而发挥抗肿瘤作用[18]。山柰酚是一种具有良好药理活性的植物黄酮类化合物。研究发现,山柰酚通过上调miR-181a表达和抑制MAPK/细胞外调节蛋白激酶信号通路、PI3K信号通路,可以抑制人胃癌细胞SNU-216的增殖,促进细胞自噬[19]。研究显示,β-谷甾醇不仅可促进人外周血单个核细胞的增殖,并增强人外周血单个核细胞对胃癌细胞SGC-7901的杀伤活性,还能抑制胃癌细胞增殖并促进其凋亡,其抗癌机制可能与β-谷甾醇通过抑制PI3K/AKT/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,MTOR)信号通路从而诱导细胞自噬有关[20-21]。豆甾醇已被证实在多种肿瘤细胞中具有潜在的抗癌活性,豆甾醇可通过抑制AKT/MTOR信号通路来诱导胃癌细胞凋亡和保护性自噬[22]。这些研究证明人参的主要有效化学成分在防治胃癌中具有重要作用。

本研究从GeneCards®、DRUGBANK、OMIM®数据库获取胃癌相关靶点,进一步筛选得到人参治疗胃癌的核心靶点,包括AKT1、JUN、TNF、PTGS2、Caspase-3、MAPK8等。AKT1是AKT的亚型之一,参与细胞增殖、血管生成、调节代谢等多种过程,推测AKT1作为AKT同源基因也可能与胃癌相关。Wang等[23]发现,JUN、AKT1等基因在关木通诱导胃癌的发病过程中起关键作用。研究显示,肿瘤坏死因子诱导蛋白是肿瘤促进剂,可以促进幽门螺杆菌的致癌性,诱发胃癌发生[24]。肿瘤相关巨噬细胞通过释放IL-6和TNF-α等炎性因子,诱导程序性细胞死亡蛋白配体1的表达,进而促进胃癌细胞的增殖[10]。这些研究表明AKT1、JUN、TNF在胃癌的发生和发展中发挥了重要作用。

GO功能富集分析结果显示,人参治疗胃癌的相关靶点主要涉及细胞薄膜筏、细胞质核周区、细胞外基质等细胞组分,以及蛋白质同源二聚化活性、DNA结合转录因子结合、半胱氨酸型内肽酶活性等分子功能,这些靶点可通过细胞凋亡、活性氧的代谢过程、对脂多糖的反应、炎症反应、上皮细胞迁移等生物过程来发挥治疗胃癌的作用。KEGG通路富集分析结果显示,人参治疗胃癌涉及的主要信号通路包括癌症相关通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、IL-17信号通路、乙型肝炎、TNF信号通路、PI3K/AKT信号通路、MAPK信号通路等。研究显示,人参皂苷通过激活活性氧介导的MAPK信号通路诱导胃癌细胞发生周期阻滞、凋亡和自噬,从而有效地抑制胃癌细胞的生长[25]。另有研究表明,人参抗胃癌的作用可能是通过调控表皮生长因子受体、MAPK1、MAPK3和IL-6等相关信号通路来实现[26]。人参皂苷还可通过阻断PI3K/AKT信号通路来抑制钙调蛋白的表达,进而促进胃癌细胞BGC-823的凋亡[27]。这些研究均证实人参治疗胃癌与PI3K/AKT信号通路密切相关,且与MAPK信号通路也可能存在一定的关联,这与KEGG富集分析结果一致。分子对接结果表明,人参的大部分主要有效化学成分与胃癌核心靶点AKT1、JUN、TNF有较好的结合性,说明AKT1、JUN、TNF可能是人参治疗胃癌的重要靶点。

综上所述,人参治疗胃癌是一个涉及多成分、多靶点、多通路、多环节的复杂过程,其主要有效化学成分人参皂苷Rh2、人参皂苷Rh4、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇通过作用于AKT1、JUN、TNF等核心靶点,主要在薄膜筏、细胞质核周区、细胞外基质中参与细胞凋亡、活性氧的代谢过程、炎症反应等进程,作用于PI3K/AKT信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路等关键信号通路,从而发挥治疗胃癌的作用。这一结论可为进一步挖掘人参的有效化学成分及其作用靶点并开展实验研究奠定了基础,也为从人参中提取有效化学成分治疗胃癌提供了参考依据。