苗药五香血藤醇提物对慢性非细菌性前列腺炎大鼠模型前列腺组织白细胞计数及卵磷脂小体密度的影响▲

李章春 孙海波 杨政敏 党荣敏 李 珀

(黔南民族医学高等专科学校1 基础医学部,2 公共课教学部,3 药学系,贵州省都匀市 558000;4 贵州医科大学附属医院病理科,贵州省贵阳市 550004)

慢性前列腺炎是男科的常见疾病,全球有3%～16%的成年男性受其困扰[1],我国慢性前列腺炎的发病率高达17.2%～24.6%[2],其中慢性非细菌性前列腺炎(chronic abacterial prostatitis,CAP)的占比达90%以上。CAP患者的主要临床表现为持续3个月以上的盆腔区域疼痛,并伴随性生活和排尿功能改变,如勃起功能障碍、排尿异常等,常用的治疗方法为口服非甾体抗炎药、α1受体阻滞剂等,然而上述药物存在视力改变、胃肠道症状等副作用,影响患者的疗效及生活质量[3]。近年来,随着祖国医学的不断发展,中医药以疗效好、副作用少等优势逐渐应用于CAP的治疗[4-5]。五香血藤是我国贵州省民间的特色苗药,具有抗肿瘤、抗氧化、活血消肿等功效,可用于治疗风湿痹痛、跌打肿痛、无名肿毒等[6]。有学者发现,炎症因子、氧化应激反应在CAP的发生与发展过程中发挥重要作用,并认为CAP的发生可能与机体自身免疫反应有关[7]。因此,本研究探讨苗药五香血藤对CAP大鼠模型前列腺组织白细胞计数及卵磷脂小体密度的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:60只雄性健康SD大鼠[长沙市天勤生物技术有限公司,动物许可证号:SCXK(湘)2019-0013],体质量200～220 g。所有大鼠适应性喂养3 d,自由饮水、进食,保持12 h光暗循环。

1.1.2 主要药物与仪器:前列舒通胶囊(保定天浩制药有限公司,国药准字Z20027140),25%消痔灵注射液(吉林省集安益盛药业股份有限公司,国药准字Z22026175),光学显微镜(重庆奥特光学仪器有限责任公司, 型号:BK500)。干五香血藤购自贵州省都匀市药材市场,由黔南民族医学高等专科学校药学系杨政敏博士进行鉴定、质控和提取。取干五香血藤15 kg,粉碎后加入萃取釜(温州中翔轻工机械厂,型号:WTD100)中,用80 L 80%乙醇萃取3次,制得浸膏1.2 kg,再经0.5%羟甲基纤维素溶液超声溶解,制成五香血藤醇提物。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型建立:按随机数字表法将60只大鼠分为正常对照组、CAP模型对照组(模型组)、阳性药物对照组(阳性药物组)、五香血藤醇提物低剂量组(低剂量组)、五香血藤醇提物中剂量组(中剂量组)、五香血藤醇提物高剂量组(高剂量组),每组10只。参照文献[8-9]的方法建立CAP大鼠模型:除正常对照组大鼠外,采用乙醚麻醉其余各组大鼠,将大鼠仰卧位固定于操作台上,常规消毒、铺巾,在大鼠下腹正中部位做2 cm纵向切口,进入腹腔后找到膀胱及两侧的前列腺,分别于两侧前列腺背叶注射0.1 mL 25%消痔灵注射液,然后逐层缝合。参照文献[10]对CAP大鼠模型制备情况进行鉴定,本研究50只CAP大鼠模型均建模成功。

1.2.2 给药方案:建模7 d后进行灌胃给药。阳性药物组灌胃20 mL/kg前列舒通胶囊水溶液[9],低剂量组、中剂量组、高剂量组分别灌胃63 mg/kg、126 mg/kg、252 mg/kg五香血藤醇提物,模型组和正常对照组灌胃20 mL/kg无菌生理盐水。每组灌胃1次/d,连续灌胃28 d。

1.2.3 实验取材:末次灌胃2 h后,将各组大鼠称重,股动脉取血后处死大鼠,剥离两侧前列腺组织,将右侧前列腺组织置于4%多聚甲醛中固定备用,左侧前列腺组织用于前列腺组织白细胞数计数及卵磷脂小体密度实验。

1.2.4 前列腺组织白细胞数计数及卵磷脂小体密度实验:参照文献[11]的方法,使用电子天平称取每只大鼠左侧前列腺组织0.15 g,加入4 μL/mg的无菌生理盐水充分研磨至匀浆液,放入试管内。另准备一支试管,加入0.38 mL白细胞稀释液(上海博湖生物科技有限公司,批号:BH-S1062),用微量移液器准确吸取上述制备好的匀浆液,擦去吸头外部的匀浆液,将吸头插入稀释液的底部,轻轻释放匀浆液,然后将吸头上移并吸取上层清液,漱洗吸管2次,用手摇动试管混合;充池,静置2～3 min,待白细胞下沉;计算低倍镜(南京尼康江南光学仪器有限公司,型号:E200MV)下计数池四角4个大方格内的白细胞总数。白细胞数计数(个/mL)=4个大方格内的白细胞总数/4×20×107。低倍镜下选取一个最佳视野评估卵磷脂小体密度,卵磷脂小体密度依据临床标准进行分级:1级为观察到1/4视野的卵磷脂小体,2级为观察到1/2视野的卵磷脂小体,3级为观察到3/4视野的卵磷脂小体,4级为观察到满视野的卵磷脂小体。根据镜下白细胞、卵磷脂小体形态不同对两者进行区分,即白细胞体积大,可见细胞内细胞核;卵磷脂小体为脂肪成分,折光性强,体积小,呈类圆形。

1.2.5 HE染色:取4%多聚甲醛固定的大鼠右侧前列腺组织进行冲洗、酒精梯度脱水、透明、浸蜡、包埋、切片,将切片烤干后进行脱蜡处理,然后置入不同浓度的酒精中脱水3 min,使用苏木精染色5 min后流水清洗3次,使用盐酸酒精分化处理30 s,充分清洗之后使用0.5%伊红液染色1～3 min,使用酒精脱水处理后进行脱蜡处理,使用中性树胶封固。在光学显微镜(上海医疗器械股份有限公司医用光学仪器厂,型号:XB-K-25)下观察前列腺组织的病理学改变。

1.3 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验;等级资料的比较采用非参数检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠前列腺组织白细胞计数和卵磷脂小体密度的比较 与正常对照组比较,模型组、阳性药物组、低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠的前列腺组织白细胞计数均升高,卵磷脂小体密度均降低(均P<0.05);与模型组比较,阳性药物组、低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠的前列腺组织白细胞计数均降低,卵磷脂小体密度均升高,且阳性药物组、高剂量组大鼠的前列腺组织白细胞计数均低于低剂量组与中剂量组,卵磷脂小体密度均高于低剂量组与中剂量组(均P<0.05);而阳性药物组与高剂量组、低剂量组与中剂量组大鼠的前列腺组织白细胞计数和卵磷脂小体密度差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

2.2 各组大鼠前列腺组织HE染色结果的比较 正常对照组大鼠的前列腺组织结构未见异常;模型组大鼠的前列腺组织有明显的慢性炎症改变,有大量淋巴细胞等炎症细胞浸润,腺体上皮细胞及纤维组织增生;与模型组相比,阳性药物组、低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠的前列腺组织慢性炎症病变均有不同程度改善,炎症细胞浸润范围缩小,腺体上皮细胞及纤维组织增生程度减轻,以高剂量组及阳性药物组的改善程度更为明显。见图1。

3 讨 论

CAP的发病机制目前尚未完全明确,有研究表明,盆底肌收缩功能异常、相关肌群活动异常等因素可使尿道张力增大,尿液中的化学物质、有害物质等经腺管口逆流侵袭前列腺,进而引发自身免疫性炎症反应,导致CAP。此外,代谢异常、雄激素缺乏、心理问题等因素均会导致CAP的发生[12-13]。既往临床上多采用口服抗生素、非甾体抗炎药等治疗CAP,但其副作用较大,且停药后容易复发[14-15]。随着对CAP治疗药物的不断探索,中医药在CAP的治疗方面展现出独特优势。《国务院关于印发中医药发展战略规划纲要(2016—2030年)的通知》[16]指出,要加强对慢性病、多发病、常见病中医药科学防治的研究,寻找新的中医候选药物,根据疾病的药物靶标进行治疗研究。这为CAP的药物治疗提供了新的研究方向。五香血藤为常绿木质藤本植物,隶属木兰科五味子属,为贵州省民间常用的民族草药,具有抗氧化、保肝、解热、抗溃疡等药理作用[17]。研究表明,五香血藤提取物能够降低类风湿关节炎大鼠模型血清炎症因子水平,并抑制人结肠癌细胞增殖[18-19]。

前列腺液由前列腺组织分泌,当前列腺出现炎症时,前列腺液的成分也发生相应改变。正常情况下,前列腺液涂片镜检的白细胞数量较少,卵磷脂小体呈均匀分布;当前列腺组织受到感染或非感染因素刺激时,血液中的白细胞渗出并堆积在前列腺组织内,进而导致炎症的发生,而当前列腺组织发生炎症时,卵磷脂小体的分泌和合成均减少[20]。因此,前列腺组织中的白细胞计数和卵磷脂小体密度可以在一定程度上反映前列腺炎症细胞的浸润程度[21]。本研究结果显示,与正常对照组比较,模型组大鼠前列腺组织的白细胞计数升高,卵磷脂小体密度降低(均P<0.05),提示CAP大鼠模型的前列腺组织存在炎症病变;与模型组比较,阳性药物组、低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠的前列腺组织白细胞计数均降低,卵磷脂小体密度均升高,且阳性药物组、高剂量组大鼠的前列腺组织白细胞计数均低于低剂量组与中剂量组,卵磷脂小体密度均高于低剂量组与中剂量组(均P<0.05);HE染色结果显示,模型组大鼠的前列腺组织有明显的慢性炎症改变;与模型组相比,阳性药物组、低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠前列腺组织的慢性炎症病变均有不同程度改善,其中以高剂量组、阳性药物组的改善程度更为明显。这提示,五香血藤醇提物能减少CAP大鼠前列腺组织的白细胞数量,提高卵磷脂小体密度,对前列腺组织慢性炎症病变起到明显的缓解作用。三萜和木脂素是五香血藤的主要活性成分,三萜类化合物尤其是其主要成分环阿尔廷类三萜的药理活性非常丰富,能够发挥抗炎作用[22],而木脂素也具有抗病毒的作用[6],这可能是五香血藤醇提物缓解CAP大鼠模型前列腺组织慢性炎症的机制之一。本研究中,相比于低剂量(63 mg/kg)与中剂量(126 mg/kg)五香血藤醇提物,高剂量(252 mg/kg)五香血藤醇提物对于CAP大鼠模型前列腺组织慢性炎症病变的改善效果更佳,但是其具体机制、最佳剂量、最佳干预时间等仍需要进一步研究。

综上所述,五香血藤醇提物能够降低CAP大鼠模型前列腺组织的白细胞计数,升高卵磷脂小体密度,改善前列腺组织的炎症病变,以252 mg/kg五香血藤醇提物的干预效果更优。由于CAP病因复杂,五香血藤醇提物对CAP的治疗作用及其具体机制仍有待深入研究和探索。