急性髓系细胞白血病淋巴细胞亚群与预后的关系

李 翠，王卫国*，罗 兵，冯 梅，周楠楠，王伟伟

（1.阜阳市人民医院检验科，安徽 阜阳 236001；2.安徽省第二人民医院检验科，合肥 230041）

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是发生于髓系造血干/祖细胞的血液细胞肿瘤，异质性较强[1-3]。根据诊疗指南的不同，可将AML 分为急性早幼粒细胞白血病（APL）和AML-非APL[4-5]。免疫细胞的监视功能在肿瘤的发生、发展和消除中发挥重要的功能，淋巴细胞亚群的数量和功能的异常与AML 的逃逸较为密切[6-7]。AML 患者淋巴细胞亚群的变化，目前相关文献报道的结果并不一致[8-10]，可能与AML 的分组有关。因此，本研究对AML 患者做进一步的分组，探讨淋巴细胞亚群变化及其临床意义，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2017年7月－2020年10月于阜阳市人民初诊的AML 患者101 例，诊疗标准依据《成人急性髓系白血病（非急性早幼粒细胞白血病）中国诊疗指南（2017年版）》《中国急性早幼粒细胞白血病诊疗指南（2018年版）》[4-5]。AML 伴骨髓增生异常相关改变、治疗相关性AML 和唐氏综合症相关的髓系增殖等患者病情复杂且病例较少，未纳入分析，排除伴活动性乙肝、丙肝和HIV 感染等病例。15 例APL患者，男8 例，女7 例，年龄17～63 岁，平均年龄（44.3±14.1）岁。AML-非APL 患者86 例，男58 例，女28 例，年龄17～78 岁，平均年龄（52.0±16.9）岁，白细胞计数（WBC）（18.46±9.11）×109·L-1，血红蛋白（Hb）（73.00±34.51）g·L-1；血小板计数（PLT）（26.00±12.82）×109·L-1；C-反应蛋白（CRP）（36.38±14.95）mg·L-1。其中AML1-ETO 阳性患者13 例、CBFβ-MYH11 阳性患者3 例、其他重现性遗传学异常6 例，临床资料见表1。按细胞遗传学将AML-非APL 患者分为预后良好19 例、预后中等43例和预后不良24 例。采用以阿糖胞苷为基础的治疗。30 例健康体检者为对照组，男20 例，女10 例，年龄19～80 岁，平均年龄（54.6±16.5）岁；3 组性别（χ2= 1.145，P= 0.564）、年龄（F= 1.940，P= 0.148）比较，差异无统计学意义。

表1 各AML 组与对照组淋巴细胞亚群比较

1.2 方法

1.2.1 淋巴细胞亚群的检测 取2 支含绝对计数微球的流式管，每管分别加入20 μL CD3/CD8/CD45/CD4 和CD3/CD1656/CD45/CD19 组合抗体，再加入50 μL EDTA 抗凝全血，避光染色30 min，溶血后上机检测，抗体、溶血剂和FACS Calibur 均购自BD公司。设门策略：低侧向散射光和强CD45 为成熟淋巴细胞群，通过CD3 阳性细胞群对所设的门进行评估。

1.2.2 随访 通过电话、门诊随访和查阅病例的方式活动患者的生存情况，末次随访时间为2020年12月1日。总生存时间（overall survival，OS）为患者确诊时间到死亡时间或随访终止时间。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0 统计软件进行数据分析，正态分布的资料用均数±标准差（±s）表示，偏态分布的资料用四分位数（M，P25～P75）表示。采用χ2检验，Kruskal-WallisH检验，F检验和q检验。通过Kaplan-Meier法进行生存分析，单因素危险分析采用Log-rank检验，预后多因素分析通过Cox比例风险回归模型进行。以双侧P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 淋巴细胞亚群结果比较

APL 组CD3+T 细胞、CD8+T 细胞、CD4+T细胞和CD19+B 细胞计数低于AML-非APL 组和对照组（均P＜0.05），NK 细胞百分比高于AML-非APL 组，无论AML1-ETO 阳性或阴性（均P＜0.05）。与对照组比较，APL 组CD4+T细胞百分比、CD4/CD8 和NK 细胞计数降低（均P＜0.05），AML-非APL 组AML1-ETO 阴性患者NK 细胞百分比降低（P＜0.05）。见表1。

2.2 不同细胞遗传学的AML-非APL 患者淋巴细胞亚群比较

预后不良组NK 细胞百分比低于预后良好组和中等组（P＜0.05，P＜0.05），CD3+T、CD4+T、CD8+T 和B 细胞计数和百分比、NK 细胞计数和CD4/CD8 比值组间比较，差异无统计学意义（P均＞0.05），见表2。

表2 不同预后遗传学的AML-非APL 患者淋巴细胞亚群比较

2.3 NK 细胞百分比与AML-非APL 患者OS 分析

将高白细胞、重度贫血、血小板重度减低、高CRP、不良遗传风险和低NK 细胞百分比（≤7%）等因子进行COX 比例风险回归模型分析，单因素和多因素结果显示，仅不良遗传风险是OS 独立的不良预后危险因子（P= 0.003），见表3。NK 百分比的P25、P50 和P75 分别为7%、11%和16%，将AML-非APL 患者分为≤7%、≤11%、≤16%和＞16% 4 个NK 百分比组，组间OS 比较差异无统计学意义（χ2= 1.714，P= 0.788），生存曲线见图1。

图1 NK 细胞百分比对AML-非APL 患者OS 的影响

表3 单因素和多因素分析影响AML-非APL 患者OS 的因素

3 讨论

化疗虽能提高一些AML 患者的存活率，但仍有较多患者疗效不佳[11-13]。近年来，增强免疫应答清除AML 细胞的治疗方式取得较为满意的临床疗效，显示了细胞免疫功能的重要性。

PML-RARα 融合基因的产生是APL 致病原因[14-15]，可使髓系细胞分化停滞，造成外周血白细胞计数普遍偏低，这也是APL 患者T、B 和NK 细胞绝对数量比AML-非APL 患者和对照组低的原因。本次实验结果发现，APL 患者NK 细胞百分比较非APL 患者高，而CD4+T 细胞百分比和CD4/CD8 比值较对照组低，虽国内尚未发现相关报道，但与研究[16]结果一致。PML 是一种泛肽类磷酸蛋白，是核小体重要的组成原件，对机体的免疫功能产生广泛的影响[17]。研究[18]发现，PML 参与胸腺中CD4+T 细胞的分化，APL 患者PML 蛋白功能缺陷，但与T 细胞亚群比例偏移是否有关，尚缺乏相关报道。由于AML1-ETO 阳性的AML 患者属于预后较好的类型，与APL 疗效有些相似。但进一步分析发现：与对照组比较，AML1-ETO 阳性患者T 细胞亚群的比例和数量差异不显著，CD4/CD8 比值降低，但差异无统计学意义，而NK 百分比低于APL组，与APL 患者淋巴细胞亚群的变化并不相似，而且AML1-ETO 阳性细胞还可通过增加CD48 的表达以抑制NK 细胞的识别，从而实现免疫逃逸[19]。AML1-ETO 阴性患者NK 百分比低于对照组和APL组，提示需要对不同遗传学的AML 患者做进一步分析，发现预后不良组仅NK 百分比低于较预后良好和中等组。NK 细胞是先天性免疫的主要组成部分，可通过细胞毒作用和分泌细胞因子发挥直接的抗肿瘤作用，并通过信号传递与其他免疫细胞一起协同控制肿瘤细胞的生存，NK 细胞的数量和功能缺陷是AML 细胞逃避免疫监视的极为重要因素[20-22]。由于本次入组的APL 患者疗效显著，预后较好，故没有分析淋巴细胞亚群变化与预后的关系。AML-非APL 患者NK 细胞数量减低是较为显著的问题，为了探讨其对生存的影响，通过生存曲线和COX 比例风险回归模型进行分析，结果显示：NK 细胞百分比与患者的OS 无关，多因素分析表明仅不良的遗传风险是影响OS 的独立危险因子，而与减低的NK细胞百分比无关。由于AML 患者NK 细胞也存在受体漂移、成熟障碍和抑制性免疫检查点分子过表达等功能性缺陷[23-24]，这可能是NK 百分比与AML-非APL 患者OS 无关的原因。本研究是单中心回顾性研究，需要前瞻性多中心研究以进一步证实。

综上所述，AML 患者不同亚型间淋巴细胞亚群分布并不相同，预后不良的AML 患者NK 细胞比例减低更明显，但NK 比例减低与AML-非APL 患者OS 无独立的相关性。