P2X7受体/NLRP3轴对痛风急性发作的调控作用机制研究

2023-06-12刘业洲崔月娜陈邬锦孙玉萍

长春中医药大学学报 2023年6期

刘业洲，李瑞，白冰，崔月娜，贺怡，陈邬锦，孙玉萍

（新疆医科大学基础医学院，乌鲁木齐 830000）

急性痛风性关节炎（Acute Gouty Arthritis，AGA）是因为尿酸钠晶体沉淀引起的一种慢性炎性风湿病[1-2]，近年来发病率逐年增高，并呈现出年轻化趋势[3-4]。该病病因可能是由于细胞外液尿酸钠或其结晶沉淀在关节滑膜组织，引起炎症反应。痛风病人的慢性炎症会持续很长时间，在急性期会加重，导致组织肿胀，但白细胞、CRP 等感染性指标不会有太大的改变，一般都是通过炎性因素来衡量炎症的严重程度[5]。P2X7 受体是一种双向功能受体，在受体的第2 跨膜区上，形成一个离子通路[6]；离子的运动与薄膜的电压有关，参与了炎症反应的发生与发展。因此，在诸多炎症性疾病均可检测到其异常的表达情况能够促进炎性介质如IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α 等释放。研究[7]表明，P2X7 可能激活其下游炎症相关的通路，通过激活NLRP3复合体，招募ASC和Caspase-1前体，使其成为有活性的Caspase-1（IL-1 转化酶），持续的ATP 刺激又可使P2X7 受体阳离子通道转变成非选择性质膜孔，便于IL-1β 释放至细胞外发挥炎性作用[8]。本研究基于NLRP3/P2X7 受体轴探讨NLRP3与P2X7 受体在痛风中的调节作用机制，以期为后续的药物研究探寻重要的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

C57 小鼠40 只，9 周龄，体质量23～30 g，雄性，由新疆医科大学提供，实验动物生产许可证号：SCXK（新）2018-0001，伦理批号：S20130418-3。试验前将小鼠置于（23±2）℃屏障级动物房中饲养1 周，标准饲料，饮用水为自来水。

1.2 药物与试剂

尿酸钠盐，由Sigma（美国）公司制造，戊巴比妥钠，购于北京源博汇科生物技术研究所。吐温-80，Sigma（美国）公司，IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA 试剂盒，购于北京欣博盛生物技术有限公司，批号：20191108；NC 薄膜，0.45 μm 孔径，德国Sartorius 制造；牛血清白蛋白（BSA），购自赛默飞（美国）公司，批号：930342；NLRP3 表达抑制剂Dapansutrile，CAS 号：54863-37-5，购自上海麦克林生化科技有限公司；P2X7 表达抑制剂A-740003，NLRP3 激活剂，货号：BMS-986299（compound 112），以上购自MedChemexpress 安诺伦（北京）生物科技有限公司。一抗：NLRP3，货号MA5-32255，稀释度1:500，ASC，货号PA5-50915，稀释度1:500，Caspase-1，货号14-9832-82，稀释度1:500，P2X7，货号PA5-28020，稀释度1:500，以上均购自赛默飞（美国）公司，IL-1β，货号ab254360，稀释度1:500，购自Abcam（美国）公司。

1.3 实验仪器

3-18K 型，冷冻型高速离心机，德国Sigma 公司生产；全自动酶标分析仪，安图实验仪器（郑州）有限公司；GLP-F300 型，全自动生化分析仪，迪瑞医疗科技股份有限公司，CS-1200 型；电泳槽，孚约生物科技（上海）有限公司，通用型；电泳仪，赛默飞生物有限公司。

1.4 模型制作及分组

将单钠尿酸盐加入0.9%的氯化钠注射液，再加入Twin-80（9:1），加1 mL 1.5 moL·L-1NaOH，加热，搅拌，配制为25 mg·mL-1的尿酸钠混合液，4℃下贮存，使用前摇匀。采用随机数表法，将C57 小鼠分成5 组，分别为对照组（0.9%的氯化钠注射液，8 只）、模型组（8 只）、C 组（小鼠模型鞘内注射P2X7 抑制剂，8只）、D组（小鼠模型鞘内注射NLRP3抑制剂，8只）、E 组（小鼠模型鞘内注射P2X7 抑制剂+NLRP3 激活剂，8 只）。模型制作参照文献[7]方法造模。使用0.9%氯化钠注射液（溶解单钠尿酸盐）C57 小鼠足部左后外侧踝部注射；以0.9%的氯化钠注射剂作为对照组，每天1 次，连续7 d。造模组关节比健侧组皮肤温度增高、肿胀、骨骼特征消失、脚爪弯曲、四肢无力负重、行走迟缓、后腿弯曲、跛行、三足步态等。

1.5 取材与指标检测

1.5.1 关节肿胀的测量在小鼠受试踝关节处做标记，造模后 1、6、12、24、48、72 h 采用爪肿测量仪测量各组小鼠右后踝关节标记以下的容积。关节肿胀度（mL） = （造模后踝关节容积-造模前踝关节容积）。

1.5.2 C57 小鼠炎症因子及相关蛋白测定 4 周后，用2%戊巴比妥钠（40 mg·kg-1体质量）进行腹腔麻醉，用765 g 离心力（离心直径8.0 cm，15 min），将上部血清吸收，-20℃保存。血清尿酸、尿素氮、肌酐的全自动生化分析仪。用酶联免疫吸附试验方法（ELISA法）测定C57 小鼠血浆中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量，并严格按照ELISA 试剂盒说明进行操作。

1.5.3 蛋白表达采用蛋白质免疫印迹法检测关节滑膜组织相关蛋白表达，戊巴比妥钠进行腹腔麻醉后，处死小鼠，取脚踝软骨组织，放在1 个预冷却的磨盘里，用液氮磨碎直到用 RIVT 分析裂解液来获取软骨组织，提取组织蛋白，用BCA 方法测定浓度。按照蛋白:5×Loading Buffer 比例为4:1 混合，在95℃孵育10 min。配制SDS-PAGE 凝胶，按照等体积上样，100 V 恒压条件下电泳100 min，此时可观察蓝色水平线进入玻璃板的底部。PVDF 膜经过甲醇活化后，以300 mA 恒流转膜60 min。5%脱脂奶粉封闭1 h。PVDF 膜放在提前稀释好的一抗内，在4 ℃过夜反应。PVDF 膜放在二抗内，摇床结合1 h。ECL 发光。加入封闭液稀释的二抗溶液（稀释浓度为1:2 000），并在室温条件下培养60 min。使用PBST 清洗后，使用ECL 发光液显影，曝光和灰度值。

1.6 统计学方法

采用SPSS 26.0 软件进行数据分析。计量资料呈正态分布，采用均数±标准差（±s）表示，多组数据比较采用单素方差分析（One-wayANOVA），多组间两两比较，采用方差分析；不同时间段比较，采用重复测量的方差分析。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 痛风性关节炎C57 小鼠模型肿胀度与IL-1β、IL-6、TNF-α 表达的情况

与对照组C57 小鼠的踝关节比较，C57 小鼠造模后踝关节的肿胀度显著升高（P＜0.05），见表1。模型组炎症因子表达水平高于对照组（P＜0.05），见表2。

表1 2 组AGA 模型C57 小鼠踝关节的肿胀度比较（± s，n= 8）

注：与对照组比较，# P ＜0.05

组别6 h24 h48 h72 h对照组 0.12±0.04 0.15±0.03 0.11±0.03 0.12±0.04模型组 0.57±0.06# 0.76±0.14# 0.71±0.09# 0.52±0.06#

表2 2 组AGA 模型C57 小鼠踝炎症因子表达比较（± s，n= 8）

注：与对照组比较，# P ＜0.05

组别IL-1βIL-6TNF-α对照组 65.69±22.160.50±0.2315.66±3.83模型组 186.43±63.11#2.87±1.46#20.08±3.01#

2.2 痛风性关节炎C57 小鼠模型中NLRP3、ASC、Caspase-1、P2X7 表达比较

与对照组C57 小鼠的踝关节比较，C57 小鼠造模后NLRP3、ASC、Caspase-1、P2X7 蛋白表达升高（P＜0.05），见表3。

表3 痛风性关节炎C57 小鼠模型中NLRP3、ASC、Caspase-1、P2X7 表达比较（± s，n= 8）

注：与对照组比较，# P ＜0.05

P2X7/β-actin对照组 0.19±0.04 0.14±0.04 0.18±0.04 0.38±0.06模型组 1.31±0.07# 1.04±0.08# 1.59±0.09# 3.26±0.14#组别NLRP3/β-actin ASC/β-actin Caspase-1/β-actin

2.3 抑制NLRP3 与P2X7 表达对小鼠模型中IL-1β、IL-6、TNF-α、P2X7、NLRP3 表达情况的影响

与模型组比较，抑制NLRP3 的表达，IL-1β、IL-6、TNF-α、NLRP3 的表达降低（P＜0.05），P2X7 的表达差异无统计学意义（P＞0.05），与模型组比较，抑制P2X7 的表达，IL-1β、IL-6、TNF-α、P2X7、NLRP3 的表达降低（P＜0.05）。见表4，图1。

图1 抑制NLRP3 和P2X7 表达对小鼠模型中P2X7、NLRP3 蛋白表达的影响

表4 抑制NLRP3 与P2X7 表达对小鼠模型中IL-1β、IL-6、TNF-α、P2X7、NLRP3 表达情况的影响（± s ，n= 8）

注：与模型组比较，# P ＜0.05

组别IL-1βIL-6TNF-αP2X7/β-actinNLRP3/β-actin对照组 64.57±23.220.52±0.2214.55±3.890.39±0.090.93±0.05模型组189.99±45.762.99±1.5424.32±3.223.34±0.151.35±0.08 C 组104.69±32.33#1.57±0.32#18.43±3.86#3.39±0.140.37±0.06#D 组136.96±37.37#1.67±0.45#16.49±3.55#2.41±0.09#1.00±0.04#

2.4 NLRP3/P2X7 受体轴对小鼠模型相关基因表达的影响

见表5，表6，图2。

图2 NLRP3/P2X7 受体轴对模型动物NLRP3、ASC、Caspase-1、P2X7 表达的影响

表5 NLRP3/P2X7 受体轴对模型动物IL-1β、IL-6、TNF-α表达情况比较（± s，n= 8）

注：与对照组比较，# P ＜0.05

组别 IL-1βIL-6TNF-α对照组 64.57±23.220.52±0.2215.55±3.89模型组 189.99±45.76#2.99±1.54#21.32±3.22#C 组104.69±32.331.57±0.7218.43±3.62 D 组136.96±37.371.57±0.7218.99±3.55 E 组176.96±43.392.87±1.5020.44±3.67

表6 NLRP3/P2X7 受体轴对模型动物NLRP3、ASC、Caspase-1、P2X7 表达的影响（± s，n= 8）

注：与对照组比较，# P ＜0.05

P2X7/β-actin对照组 0.19±0.04 0.14±0.04 0.18±0.04 0.38±0.06模型组 1.31±0.07 1.04±0.08 1.59±0.09 3.26±0.14 C 组0.37±0.06 0.39±0.05 0.44±0.06 3.39±0.45 D 组1.00±0.06 0.64±0.05 0.74±0.07 0.41±0.09 E 组1.07±0.07# 0.92±0.06# 1.23±0.07# 3.30±0.14#组别NLRP3/β-actin ASC/β-actin Caspase-1/β-actin

3 讨论

痛风性关节炎是由于患者嘌呤代谢能力较低，血尿酸水平增高，形成尿酸盐，积存于关节相关软组织，引起关节部位出现炎症和病损，多发于中年男性[9]。痛风可以喝一些低脂饮食来降低尿酸值，避免复发。痛风的家族性、基因类型目前的研究还不够全面[10]，痛风可引起关节囊、滑囊、骨质、软骨及其他组织的炎症反应，主要表现为高尿酸血症、软组织损伤及反复的关节炎，可分为急性或长期，且易复发，严重时会引起关节的腐蚀和损伤，活动障碍合并症、发病与促进嗜酸性白细胞浸润、生成促炎细胞因子等因素相关，是一种以炎症为特点的代谢性自限性疾病，尿钠通过炎性组织液进入关节软骨，侵入关节的软骨，造成骨质疏松，导致损伤是痛风发生的病机与重要因素[11]。近年来，随着临床上痛风发病率的急剧增加，该疾病已经引起病患家属以及全社会的广泛关注。随着不同的医学研究团体的深入研究，痛风的致病机理与调控机制逐步被人们认知。本研究探讨痛风发作的分子机制，以期为后续药物的开发与深度理解疾病的发病机制提供参考。

本研究采用C57 小鼠模型进行研究。模型动物的炎症因子显著高于对照组动物，且P2X7 与NLRP3 基因的表达显著高于对照组（P＜0.05）。本研究与研究[12-13]结果一致，均证实了P2X7 与NLRP3 在痛风相关疾病中的差异表达。本研究在抑制P2X7 表达后的结果证实，小鼠模型的炎症因子表达显著降低，即炎症作用显著降低，证明P2X7高表达可能是导致痛风炎症作用的潜在分子机制之一；单独抑制NLRP3 的表达，得到了与上述研究相类似的结果，综合以上结果表明，NLRP3 与P2X7的高表达可能是导致模型动物炎症的重要内在机制，研究[14-17]均支持本研究的结论。并且，本研究结果证实了NLRP3 与P2X7 受体在模型动物中调控作用。本研究将P2X7 的表达抑制，并同时过表达NLRP3表达，进一步证明了P2X7 对下游NLRP3 的调控作用，证明P2X7 是通过NLRP3 进一步发挥小鼠模型中的炎症作用。

本研究结果证实了P2X7 受体/NLRP3 轴在调控痛风发作小鼠模型中的潜在机制作用，并且与多个相关性研究结果进行对比，进一步证实了本研究结果的可靠性。王敬博[18]研究表明青梅复方对急性痛风性关节炎的干预作用可能是通过NLRP3 发挥作用，邢艳阳[19]证实了NLRP3 与P2X7 在泻浊解毒通络法治疗急性痛风的作用机制，康佩芝[20]的研究结果表明了P2X7R/NLRP3 信号通道在痛风清热方对急性痛风性关节炎C57 小鼠局部组织中炎性信号表达的机制作用。以上研究结果均证实了本研究的靶点通路可能在后续的药物研发和新治疗方法中的潜在靶点作用。

综上所述，本研究证实了P2X7R/NLRP3 信号通道在痛风小鼠模型中的作用机制，为后续的药物开发与新型治疗方法的靶点选择提供了见解与支持。