力学刺激促进软骨修复的研究进展

陈继鑫 周沁心 余伟杰 韩金昌 刘爱峰

关节软骨由软骨细胞和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)组成,其功能是承受机械载荷,抵抗关节运动产生的压应力和拉应力。由于膝关节软骨无血管、无神经、缺乏干细胞等因素,其修复潜力有限,一旦生物力学特性受损,极易发生膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)。关节软骨退行性病变的高发和严重程度,推动了以生物力学为基础的软骨组织工程的发展[1,2]。软骨细胞对机械刺激的反应具有高度选择性,例如生理负荷和频率下的动态静水压和直接压缩可刺激再生代谢,但异常的机械刺激,如静态压缩、拉伸和损伤性压缩,也可导致软骨分解和代谢变化。近年来,研究证实直接压缩力、静水压力、低剪切力以及电磁力可增加ECM中聚集蛋白聚糖(aggrecan,ACAN)和Ⅱ型胶原蛋白(type Ⅱ collagen,COL-2)的mRNA表达,促进软骨修复。本文总结了不同力学环境对软骨修复的作用,以及软骨细胞将力信号转化为细胞内化学信号的途径。

一、直接压缩力

在生理条件下,关节软骨的压缩模量在(0.4～2.0)MPa之间[3]。软骨的动态压缩导致基质变形、流体流动、流动电位和电流以及物理化学变化。直接压缩力导致软骨细胞变形,压缩影响软骨细胞中的细胞内Ca2+浓度。这一过程主要通过两种方式调节:Ca2+依赖性通道的直接机械激活和膜电位的间接改变,膜电位的改变通过电压操纵的钙通道来维持[4,5]。直接压缩力可增加ACAN、COL-2的mRNA表达,对软骨细胞增殖具有促进作用。软骨细胞的力效应取决于加载的压力大小、程度以及作用方式等因素。直接压缩力可通过涉及激活环磷酸腺苷(cyclic adenosine phosphate,cAMP)和磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)信号级联转导机制,从而诱导ACAN mRNA水平升高。在直接压缩力诱导信号的转导中,cAMP 和PI途径存在共同的下游介质。信号转导的一种机制可能是通过压缩应力选择性激活作用,致使关键酶和介质的下游磷酸化;另一种机制是受到短期的压缩应力产生的信号通过cAMP和PI途径平行转导到细胞核,产生协同作用,激活ACAN mRNA的转录[6]。具体机制如图1所示。

图1 直接压缩力作用软骨细胞信号机制图

Paggi等[7]对负载 3D软骨细胞的琼脂糖水凝胶上施加0.03MPa、1Hz的直接压缩力,结果显示暴露于压缩后,软骨细胞SOX9mRNA的表达水平高约3倍,并且全面增强了软骨 ECM标志物的产生,如ACAN、COL-2和 COL-5,同时 COL-1 mRNA表达减少。整合素是跨膜蛋白,能够激活内部细胞信号,并通过与COL-2、COL-5和纤维连接蛋白形成键,将软骨细胞连接到ECM[5]。纤维连接蛋白是A5B1整合素的ECM配体,整合素可能参与从细胞外基质向关节软骨中的软骨细胞传递压缩诱导信号,整合素与PI信号通路偶联[8]。整合素在软骨机械传递中起着重要的作用[9,10]。

Ren等[11]研究表明,在压力范围[(0～0.2)MPa]和频率0.1Hz的周期性机械应力作用下,软骨细胞增殖和基质合成显著增加,这与并与 Src、PLCγ1、MEK1/2和 ERK1/2的磷酸化水平升高相关。并且通过使用特异性抑制剂探索Src、PLCγ1、MEK1/2和 ERK1/2之间关系的表达和性质,研究结果表明,周期性机械应力不仅导致软骨细胞增殖,增加ACAN和COL-2基因表达,而且还通过Src-PLCγ1-MEK1/2-ERK1/2信号通路促进软骨细胞增殖和基质合成,该信号通路将这3个重要的信号分子连接成有丝分裂级联。Ge等[4]对于滑膜间充质干细胞-琼脂糖构建体施加0.25Hz、1MPa的循环动态压缩(1h/d),结果发现肥大基因表达的显著减少,如 COL-1、COL-10、RUNX2和MMP13等,表明直接压缩力可以抑制软骨细胞的肥大。循环动态压缩促进了ACAN和 COL-2的基因表达以及软骨形成主基因 SOX9的表达水平。此外,在整个实验期间,转化生长因子-β3(transforming growth factor-β,TGF-β3)被添加到诱导培养基中。与单独机械压迫刺激比较,单独 TGF-β3导致 sGAG和胶原含量更大的积累,说明TGF-β3在维持ECM形态方面发挥积极作用[12]。

二、静水压力

静水压力能够使膝关节软骨表面具有极低的摩擦系数,使膝关节有限地变形,修饰细胞形态,这是关节软骨能够承受高强度关节载荷的重要原因[13,14]。许多体外研究已经证实了静水压对软骨组织外植体、分离的软骨细胞、工程软骨组织的影响。力学实验证明,日常活动下,关节内软骨细胞承受的静水压力水平为(0.1～20.0)MPa[15]。实验研究证实,体外施加静水压力会影响关节软骨基质代谢。与正常软骨细胞比较,OA软骨细胞中线粒体和高尔基体的数量减少,形态学表现为细胞受损的迹象,细胞中富含空泡化以及边缘染色质的比例增加。加载静水压力后,OA软骨细胞中细胞质、细胞器数量的恢复与之前的观察结果一致,表明周期性低压力下软骨细胞代谢活性增加[16]。具体机制如图2所示。

图2 静水压力作用软骨细胞信号机制图

静水压力(hydrostatic pressure,HP)可通过Wnt/β-catenin途径调节软骨细胞代谢,增加COL-2和B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)的表达,以及软骨形成关键转录因子Sox9的表达,但对Ⅰ型胶原的表达无影响。HP作为miRNA基因表达的调节器的重要性已被充分报道[17]。Cheleschi等[18]将软骨细胞被暴露在循环的低HP[(1～5)MPa]和连续的静态HP(10MPa)下3h。低周期的HP明显减少了细胞凋亡、MMP13、血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5(A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5,ADAMTS5)、miR-146a和miR-181a的基因表达,观察到COL-2和Bcl-2表达的增加。当应用10MPa的过载HP时,观察miR-146a和miR-181a的表达增强。HP在诱导人类软骨细胞中miRNA表达的显著变化,表明miRNA是机械载荷调节软骨细胞代谢的潜在媒介。许多研究证明,在OA大鼠模型的关节软骨中Wnt/β-catenin途径被激活,以及在体外软骨细胞中低HP的调节β-catenin mRNA和蛋白表达[19,20]。β-catenin蛋白的表达在暴露于HP (1～5)MPa的细胞中减少。在连续的静态HP应用后,得到了相反的结果。这是由于OA软骨细胞被miR-34a特异性抑制剂暂时沉默时,β-catenin蛋白的表达减少;此外,miRNA的抑制限制了过载HP对β-catenin表达的负面影响,并增强了低循环压力的影响。Savadipour等[21]使用琼脂糖中猪软骨细胞的3D模型在 0.5Hz、每天 5MPa的流体静水压力下培养,应用特定的化学抑制剂来确定瞬时受体电位(transient receptor potential,TRP)离子通道TRPV1、TRPV4、TRPC3和TRPC1在传导流体静水压力中的作用。结果显示,静水压力抑制了硫酸化糖胺聚糖(sulfated glycosaminoglycan,S-GAG)的产生。抑制TRPC3和TRPV4,则会降低S-GAG含量;然而,只有TRPV1的抑制部分减弱了静水压负荷诱导的S-GAG含量的减少。这表明TRPV1通道可能作为软骨细胞中流体静水压力的传感器,调节软骨细胞合成代谢。Parkkinen等[22]还研究发现,在单层培养的牛软骨细胞中,应用同上一研究中使用的动态静水压加载方案(5MPa、0.5Hz、1.5h)也会抑制S-GAG的产生,对软骨外植体应用相同的加载却能促进S-GAG的产生。综上所述,静水压力的加载持续时间和软骨细胞培养系统[单层(2D)或水凝胶(3D)、支架、凝胶或颗粒)以及软骨外植体(3D)]对软骨细胞响应静水压力的效应有显著影响,改变其中任何一种条件,结果都可能完全不同。

Chen等[23]使用新型HP生物反应器,对体外软骨模型实现了在(5～10)MPa静水压力下进行8周培养,通过与其他两种类型的机械刺激(剪切应力和离心力)进行静态培养的比较。体外三维软骨再生的结果显示,与其他组比较,HP组实现了最佳的软骨形成,在细胞增殖、湿重、软骨厚度、组织均匀性、软骨ECM含量和机械性能等方面比较,差异均有统计学意义。HP的主要机制可能是促进细胞增殖和ECM的产生,这与既往研究报道一致,HP可以调节关键的信号通路,刺激生长因子的分泌,从而促进细胞增殖和ECM的产生。据推测,HP可以通过增加扩散压力促进物质交换,从而有助于改善内部的软骨形成,这可能是HP组的软骨厚度明显高于其他组的一个重要原因。第3个机制是软骨ECM大分子的交联增强。ECM大分子的交联水平是决定体外循环机械性能的重要因素。根据目前的结果,HP组的主要交联分子含量、调节交联的关键酶水平和杨氏模量都明显高于其他组,表明HP可能通过提高ECM大分子的交联水平来改善体外循环的机械性能。这一点从胶原纤维的密度和排列上得到了进一步的支持。

软骨细胞感知环境压力变化的机制研究可能是未来生物力学研究软骨修复的热点领域。有必要评估TRPV1的机械激活与热激活或pH激活如何诱导不同的细胞信号通路,软骨细胞中ERK通路的负调节作用以及SOX9 mRNA的表达,进一步探讨信号级联通路是如何被静水压力激活,进一步研究确定刺激软骨细胞代谢的最佳负荷条件,促进软骨修复。

三、剪切力

低流体剪切力对软骨具有保护作用,高剪切力可能导致炎症、细胞死亡和软骨降解。低剪切力可通过抑制单磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)/去乙酰化酶-1(sirtuin-1,SIRT1)通路,调节抵抗素诱导的人OA软骨细胞COX-2表达。此外,低剪切力可通过ERK5诱导过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators activate receptors,PPARγ)转录活性,激活转录因子Kruppel样因子4(kruppel-like factor 4,KLF4),降低IL-1β诱导的NF-κB的水平,达到软骨保护的作用。具体机制如图3所示。

图3 剪切力作用软骨细胞信号机制图

Su等[24]研究发现,血清和滑液中抵抗素水平与KOA严重程度呈正相关,对人OA软骨细胞施加短时间(1～2h)低剪切力(2dyn/cm2),发现剪切力通过抑制NF-κB 和环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB),减弱抵抗素对 COX-2 表达的影响。然而,施加较长时间(3～4h)剪切力会增加 NF-κB 转录活性,从而增强了抵抗素对 COX-2 表达的影响。NF-κB 可能是低剪切力的主要下游转录因子,以控制抵抗素刺激的人 OA 软骨细胞中 COX-2 的表达。此外,两种剪切模式对抵抗素刺激的COX-2表达的调节是通过增加AMP激活的AMPK/SIRT1通路的表达来实现的。Guan等[25]将高流体剪切力(20dyn/cm2)48h持续作用于人类软骨细胞,发现COX-2、IL-1β和成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factor-2,FGF-2)水平上调,MMP-1表达显著增加。IL-1β、COX-2依赖性PGE2激活PI3K-Akt和p38信号通路,这些信号通路又通过NF-κB和c-Jun-反式激活途径负责MMP1的合成。综上所述,不同强度的剪切力和持续时间可能具有调节软骨细胞信号转导和功能的差异,从而控制软骨代谢稳态。

既往研究发现,KLF4在胃肠道、血管、皮肤、骨骼和其他组织中高表达。KLF4可在小鼠关节软骨细胞中表达,其活性与小鼠关节软骨细胞外基质的成熟以及基质金属蛋白酶和凝集酶的表达有关。Chang等[26]研究发现,在人软骨细胞中,2dyn/cm2剪切力通过ERK5诱导PPARγ转录活性以增加KLF4转录,再由KLF4诱导减弱IL-1β刺激的NF-κB激活,从而降低了IL-1β诱导的NF-κB的水平。通过荧光素酶实验和染色质免疫共沉淀实验证实了PPAR γ在KLF4基因启动子中的结合。既往研究也已经证明,PPAR γ是软骨细胞中的软骨保护转录因子,其表达和激活可以延缓OA的发展,起到软骨保护的作用。在人类软骨细胞中,EKR5和PPAR γ作为正机械调节因子,可响应2dyn/cm2剪切力来激活KLF4转录的软骨保护作用。相反,PPAR γ也被发现在高强度剪切力刺激的软骨细胞中发挥作用,导致软骨细胞凋亡。KLF4的软骨保护作用,为今后OA患者的临床治疗提供新的途径。

四、电磁力

电磁力(pulsed electromagnetic fields,PEMF)是物理学上沃尔夫定律、胶原的压电特性和流电位的概念,能够促进骨和软骨生长。PEMF已被证明可以刺激人关节软骨细胞增殖,并增加牛关节外植体和猪软骨细胞中软骨ECM的生成,并减少促炎性细胞因子的释放,抑制软骨细胞凋亡[27]。PEMF在软骨内成骨过程中刺激大鼠蛋白多糖(proteoglycan,PG)和COL-2 mRNA表达增加[28]。这些研究表明,PEMF可能有助于保护软骨的完整性和功能。具体机制如图4所示。

图4 电磁力作用软骨细胞信号机制图

TGF-β在维持软骨稳态和ECM形态方面发挥积极作用。TGF-β1刺激COL-2的合成,可抑制大鼠膝关节软骨软骨细胞凋亡和MMP13表达。Ye等[29]将OA模型小鼠暴露于1.6mT、频率为75Hz,PEMF以延缓软骨退化,保护软骨下骨小梁微结构。PEMF促进ACAN的表达,抑制 IL-1β、ADAMTS4和MMP13的表达。此外,体外研究中,PEMF刺激了牛软骨用高剂量的 IL-1β培养的外植体。结果表明,PEMF对软骨细胞增殖和细胞外基质成分有积极影响,并且可用于保护软骨免受骨关节炎期间高炎性细胞因子水平的有害影响。Stefani等[28]对犬软骨移植模型予以1.5mT、频率为75Hz的PEMF刺激,结果在成熟软骨外植体中观察到明显的GAG和COL-2沉积,软骨缺损部位再生。这些研究表明,PEMF可以增加关节软骨基质合成代谢,减少炎性细胞因子表达和关节软骨基质分解代谢,在治疗软骨退变方面有巨大的潜力。

Varani等[30]研究报道,PEMF可增强间充质干细胞的成骨和软骨分化。PEMFs暴露通过直接激活成软骨信号通路(即 TGF-β/SMAD)和间接旁分泌机制(由 MSC分泌蛋白介导)增强 MSC成软骨分化。PEMFs刺激还可作为 MSCs和软骨细胞的趋化信号,从而有利于细胞迁移至损伤部位,促进组织修复。此外,PEMFs对软骨细胞增殖和细胞外基质成分有积极影响,发挥强大的抗炎作用,保护软骨组织免受促炎性细胞因子分解代谢活性的影响。PEMF还可以上调X-连锁凋亡抑制蛋白的表达,下调Bcl相关蛋白(Bcl-associated X-protein, Bax)的表达,被认为是最有效的caspase抑制剂。caspase家族是细胞凋亡过程中的关键分子,caspase抑制剂能够有效地抑制caspase的活性,阻止细胞凋亡,这可能与抑制MAPK信号通路有关。Yang等[31]研究显示,PEMF改善了软骨基质软骨细胞凋亡和自噬,PEMF通过抑制TNF-α和IL-6信号转导,减轻OA的进展。PEMF处理后(75Hz、3.8mt、1h/d)的OA兔和大鼠关节软骨中Bax和caspase-3的表达降低, TNF-α和IL-6信号可能是PEMF保护软骨细胞凋亡和自噬的关键因素,该研究具有软骨保护的潜在价值。

五、展 望

近年来通过生物力学刺激软骨以及软骨细胞的研究,调节软骨细胞代谢,达到修复软骨的作用,这为临床进行骨修复与重塑提供了新的思路与方法。本文中直接压缩力、静水压力、低剪切力以及电磁力,在各种体内及体外力学实验中,可通过各种物理刺激转化为化学刺激的信号通路与分子机制,增加COL-2和ACAN的表达,降低炎性细胞因子的表达,抑制ECM的降解,起到软骨保护的作用。然而,不同类型机械应力、力的加载持续时间、频率和软骨细胞培养系统都对软骨细胞响应力学刺激有显著的影响,各个因素以及物理刺激转化为化学刺激的信号通路与分子机制仍需进一步探索。

目前,研究力学载荷影响软骨修复尚处于初步阶段,许多力学响应的作用靶点、调控机制尚不明确。软骨细胞感知环境压力变化的机制研究可能是未来生物力学研究软骨修复的热点领域,有助于更好地理解软骨细胞的力学传导,以及机械应力在组织工程和软骨修复中的作用。此外,了解软骨细胞的机械转导途径可能有助于开发能够刺激软骨细胞合成代谢途径或抑制分解代谢途径的药物,从而进一步研究确定刺激软骨细胞代谢的最佳负荷条件,促进软骨修复,为临床治疗KOA提供新思路与方法。