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桔梗皂苷D对大鼠溃疡性结肠炎的改善作用及对TLR4/NOD信号通路蛋白表达的影响

2023-06-09金蕾朱轶

广州中医药大学学报 2023年6期
关键词:桔梗溃疡性结肠炎

金蕾, 朱轶

(1.上海市第六人民医院中医科,上海 201306;2.上海市第六人民医院针推伤科,上海 201306)

溃疡性结肠炎是结肠黏膜的特发性慢性炎症性疾病,其始于直肠,通常以连续的方式通过部分或整个结肠向近端延伸,血性腹泻为本病的特征性症状,具有恶化和缓解交替发作、进行性且不可预测的病程特点[1]。中医药治疗溃疡性结肠炎疗效确切,显示出广阔的应用前景。溃疡性结肠炎归属于中医学“泄泻”“痢疾”等范畴。“肺与大肠相表里”理论在泄泻、痢疾治疗中具有重要的指导意义。桔梗为桔梗科植物桔梗Platycodon grandiflorum(Jacq.)A. DC.的干燥根,味苦、辛,性平,归肺经,具有宣肺、利咽、祛痰、排脓、止泻功效,《神农本草经》亦有记载桔梗主“腹满肠鸣幽幽”,常用于治疗咳嗽痰多、胸闷不畅、咽痛音哑、肺痈吐脓、痢疾腹痛等病症。中医临床治疗溃疡性结肠炎配伍桔梗,往往起到良好的治疗效果[2-4],体现了“肺与大肠相表里”的特征。桔梗皂苷D(platycodin D)是从桔梗中分离提取的一种三萜类单体,是桔梗的主要有效成分,在抗炎、镇痛、抗肿瘤、保肝、调节免疫等方面均表现出良好的药理活性[5]。既往有研究[6]表明,桔梗皂苷D可减弱硫酸葡萄糖钠(DSS)诱导的结肠炎和脂多糖(LPS)诱导的炎症。本研究建立DSS诱导构建溃疡性结肠炎大鼠模型,观察桔梗皂苷D 对溃疡性结肠炎大鼠的治疗作用及机制,现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物50 只SPF 级雄性Wistar 大鼠,8 周龄,200 ~230 g,购自成都达硕实验动物有限公司,动物生产许可证号:SCXK(川)2019-028。在上海市第六人民医院实验中心开展实验。动物实验方案已经上海市第六人民医院动物护理与使用委员会批准。

1.2 药物、试剂与仪器桔梗皂苷D(分子式C57H92O28,分子量1 225.320 00,纯度98%),成都格利普生物科技公司生产(CAS号:58479-68-8);硫酸葡萄糖钠[DSS,生工生物工程(上海)股份有限公司]。兔抗NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)、β-actin 等抗体(美国Abcam 公司)。倒置显微镜(日本尼康公司)。

1.3 分组、造模与给药将50 只大鼠随机分为5 组,包括正常组,模型组,桔梗皂苷D 低、中、高剂量组,每组10 只。除正常组大鼠给予蒸馏水饮用外,其他组大鼠通过在饮用水中施加5%DSS 7 d诱导构建溃疡性结肠炎模型[7]。实验第2 ~8周,桔梗皂苷D 低、中、高剂量组大鼠分别灌胃10、25、50 mg·kg-1·d-1桔梗皂苷D混悬液,正常组和模型组大鼠灌胃等体积蒸馏水。给药期间,每日观察大鼠体质量、粪便性状、隐血便血。于实验第8 周后,颈椎脱臼处死大鼠,收集结肠标本。

1.4 观察指标与方法

1.4.1 体质量 实验第2 ~8周,各组大鼠每日进行体质量测量。

1.4.2 疾病活动指数(DAI) DAI 是公认的评价“实验性结肠炎”严重程度的重要指标。实验第2 ~8 周,通过体质量变化、粪便稠度和大便潜血每日计算DAI。DAI=(体质量变化、大便稠度和出血的综合评分)/3[7]。DAI评定标准见表1。

表1 疾病活动指数(DAI)评分标准Table 1 Disease Activity Index(DAI)scoring criteria

1.4.3 存活率 于实验第2 ~8周,每周计算存活率,存活率(%)=存活大鼠数/大鼠总数×100%。

1.4.4 结肠长度和结肠质量 实验第8 周后,颈椎脱臼处死大鼠,分离结肠,生理盐水冲洗,除去脂肪及肠系膜,滤纸吸干,称质量并测量其长度。

1.4.5 苏木素-伊红(HE)染色法观察结肠组织病理形态并进行组织学评分 去除严重损伤的结肠组织并将其固定在10%中性福尔马林溶液中。石蜡包埋、切片后,进行HE染色。结肠组织病理学评分标准参照Erben等[8]的方法,见表2。

表2 结肠组织病理学评分标准Table 2 Colonic histopathological scoring criteria

1.4.6 Western Blot 法检测结肠组织NLRP3、TLR4、MyD88蛋白表达 取结肠组织,采用RIPA裂解缓冲液裂解,离心收集上清液。使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒测定蛋白的浓度。上样,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后,将蛋白转移到尼龙膜上。将膜与按体积比稀释的第一抗体NLRP3(1∶1 000)、TLR4(1∶1 000)、MyD88(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000),4 ℃孵育过夜,TBST 洗涤3 次,将膜与第二抗体辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG 室温孵育1 h,TBST 洗涤3 次。使用ECL 法可视化,应用ImageJ软件进行灰度分析,β-actin作为内参。

1.5 统计方法分别采用SPSS 21.0统计学软件和GraphPad Prism 8.0 软件进行数据分析和作图,所有数据以均数±标准差(x±s)表示。2组比较采用t检验;多组比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),事后检验采用Tukey’s 多重比较法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较图1 结果显示:与正常组比较,模型组大鼠体质量,生存率,结肠长度、质量均显著降低,DAI 评分显著升高(均P<0.01);与模型组比较,桔梗皂苷D低、中、高剂量组大鼠体质量,生存率,结肠长度、质量均显著升高,DAI评分显著降低,其中,桔梗皂苷D中剂量组效果更明显,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

图1 各组大鼠一般情况比较(±s)Figure 1 Comparison of the general situation among each group of rats(±s)

2.2 各组大鼠结肠组织病理形态及组织学评分比较图2-A 结果显示:正常组大鼠结肠黏膜完整,腺体排列规律,隐窝正常,肠腺上皮细胞结构正常,无溃疡,无炎性细胞浸润,少量杯状细胞。模型组大鼠结肠组织基本结构受损严重,黏膜上皮破损,杯状细胞肿胀,黏膜、黏膜下层和肌肉层可见明显的炎性细胞浸润。与模型组比较,桔梗皂苷D 低、中、高剂量组可见结肠黏膜相对完整,腺体良好,轻微充血和水肿,炎症细胞浸润减少。

图2 各组大鼠结肠组织病理形态及组织学评分比较Figure 2 Comparison of colonic histopathological morphology and histological scores among each group of rats

图2-B 结果显示:与正常组比较,模型组结肠组织病理学评分升高(P<0.001);与模型组比较,桔梗皂苷D 低、中、高剂量组结肠组织病理学评分显著降低(P<0.05或P<0.01)。

2.3 各组大鼠结肠组织TLR4、MyD88 和NLRP3蛋白表达比较图3结果显示:与正常组比较,模型组中TLR4、MyD88和NLRP3的蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,桔梗皂苷D 中剂量组的TLR4、MyD88和NLRP3蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。

图3 各组大鼠结肠组织TLR4、MyD88和NLRP3蛋白表达比较Figure 3 Comparison of protein expressions of TLR4,MyD88 and NLRP3 in colon tissue among each group of rats

3 讨论

溃疡性结肠炎的特征包括肠道炎症和肠屏障功能的损害。本研究采用灌胃5%DSS 法构建溃疡性结肠炎大鼠模型,结果显示,DSS诱导的溃疡性结肠炎大鼠可见体质量、生存率、结肠长度和结肠质量降低,疾病活动指数(DAI)和结肠组织病理学评分升高。而经桔梗皂苷D治疗后,可提高DSS诱导的溃疡性结肠炎大鼠体质量、生存率、结肠长度和结肠质量,降低结肠DAI 和结肠组织病理学评分,表明桔梗皂苷D 对溃疡性结肠炎模型大鼠具有明显的治疗作用。

Toll样受体4(TLR4)和核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)是模式识别受体的关键蛋白质家族,它们参与介导炎症过程并在包括肠道在内的多种组织中表达[9-10]。跨膜TLR4是TLR的主要成员,TLR通过感知病原体相关的分子模式在先天免疫和炎症中起重要作用[11-12]。TLR4 是重要的炎症途径,在肠道中高度表达。TLR4 的激活参与溃疡性结肠炎病理过程,越来越多的研究报道了结肠炎患者肠道组织中TLR4表达上调[13-15]。在结肠炎中,TLR4上调激活髓样分化因子88(MyD88)依赖性信号通路,触发NF-κB p65 转录应答,诱导巨噬细胞、树突状细胞和上皮细胞分泌促炎细胞因子[16]。本研究结果显示,DSS诱导溃疡性结肠炎大鼠结肠组织TLR4及其下游MyD88蛋白表达水平升高,而桔梗皂苷D治疗可以降低其表达。

TLRs 和NODs 是先天性免疫的关键组成部分,可识别标志性的病原体相关微生物化合物[17-18]。Chen等[19]研究发现,通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的激活和下调NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体的活性可改善结肠炎中的组织损伤。在识别微生物模式后,TLRs 和NODs触发细胞内信号通路,诱导NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)激活[20]。NF-κB 和MAPKs的激活引起促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素6(IL-6)的释放。过量的促炎细胞因子可以造成各种炎症紊乱或组织损伤[21]。研究[22-24]报道,TLRs和NODs 的激活会刺激肠道炎症。TLRs 和NODs 下游级联信号的下调也参与了肠屏障修复和完整性的调节[25-26]。因此,本研究又检测了NLRP3炎性小体的表达情况,结果与TLR4具有同样的表达趋势。

综上所述,桔梗皂苷D 可改善溃疡性结肠炎大鼠肠道形态,减轻炎症反应,其机制与通过TLR4/NOD信号通路缓解肠道炎症有关。

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