基于网络药理学探讨补肾和脉方核心药物治疗高血压的作用机制

姚晓东,张蕴慧

目前,原发性高血压的发病率逐年增高,且具有年轻化、多并发症等特点。长时间处于高血压状态可导致机体代谢紊乱,认为高血压是导致脑卒中、糖尿病、高血压性心脏病、肾小球动脉硬化的高危风险因素[1-2]。目前,西医对高血压的治疗多采用对症治疗策略,即使用血管紧张素转化酶抑制剂、β-受体阻滞剂、钙离子通道阻滞剂、肾髓袢利尿剂等实现针对性的降压[3-4]。与西药相比,中药可通过多成分、多途径、多靶点调节血压,且具有个体化、毒副作用较小、用药加减灵活等特点[5-6]。因此,加强中药在高血压治疗方面的探索研究具有重要的理论及应用意义。

高血压属于中医学眩晕、头痛、中风等范畴,认为高血压的主要诱因为情志内伤、劳倦虚衰、饮食失节,其病机演变过程为肝失疏泄、脾失健运、肾气亏虚[7],针对高血压的中医学特征,山东中医药大学附属医院周次清教授以“从肝肾分期论治高血压”专病学术思想为依托,自拟了补肾和脉方用于高血压的治疗并取得了较好的临床应用疗效[8]。但因中药复方具有多药物成分、多干预途径、多治疗靶点的特点,目前对补肾和脉方药物成分治疗高血压多靶点协同机制尚未完全阐明。为此,本研究将围绕补肾和脉方中杜仲、泽泻、黄芪、怀牛膝、地龙5味核心药物,利用网络药理学探究补肾和脉方核心中药改善高血压的治疗机制。

1 资料与方法

1.1 中药复方活性成分的收集 登陆中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php),分别以“杜仲”“泽泻”“黄芪”“怀牛膝”“地龙”为关键词,对上述中药的化学成分进行检索。对在TCMSP中能够检索到的活性成分,以口服生物利用度(OB)>30%且类药性(DL)>0.18为条件,筛选得到杜仲、泽泻、黄芪、怀牛膝、地龙5味中药的活性成分。

1.2 药物成分对应靶点的收集 根据检索获得的杜仲、泽泻、黄芪、怀牛膝、地龙活性成分,分别在TCMSP数据库中获得其成分对应的靶点蛋白,并在PubChem数据库下载各活性成分分子结构式,将其导入SwissTargetPrediction数据库(http://www.swiss targetprediction.ch/)及SEA数据库(https://sea.bkslab.org/)进行靶点预测并上传至UniProt蛋白质数据库(https://www.uniprot.org/)标准化蛋白质靶点信息,即得到杜仲、泽泻、黄芪、怀牛膝、地龙活性成分作用靶点。

1.3 杜仲、泽泻、黄芪、怀牛膝、地龙治疗高血压的潜在靶点获取 通过OMIM数据库(https://omim.org/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)及DrugBank数据库(www.drugbank.ca/),以“hypertension”为关键词检索及去重后获得高血压相关靶点。基于在线软件Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)对杜仲、泽泻、黄芪、怀牛膝、地龙活性成分的作用靶点及高血压相关靶点取交集,两者共有的靶点即是杜仲、泽泻、黄芪、怀牛膝、地龙组方治疗高血压的潜在作用靶点。

1.4 药物-成分-靶点网络的构建 整理杜仲、泽泻、黄芪、怀牛膝、地龙组方治疗高血压的潜在干预靶点及其对应的药物成分,并导入Cytoscape 3.9.0软件进行可视化网络的构建,获得杜仲、泽泻、黄芪、怀牛膝、地龙组方药物成分-高血压干预靶点的关系网络。在Cytoscape 3.9.0软件中计算出关系网络的每个节点的度值(Degree),其值越大,认为可作用于该靶点的活性成分越多。

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络的构建及拓扑结构分析 将杜仲、泽泻、黄芪、怀牛膝、地龙组方治疗高血压的潜在靶点导入STRING 11.5(https://string-db.org/)数据库中,设定最高置信度为0.9,获取网络信息;将网络信息导入Cytoscape 3.9.0软件,使用Cytohub插件计算介数中心性(betweenness,BC),并构建PPI核心子网络,筛选出杜仲、泽泻、黄芪、怀牛膝、地龙组方治疗高血压的核心靶点。

1.6 基因富集分析 在R 3.5.0软件中,基于clusterProfiler包,对筛选得到的杜仲、泽泻、黄芪、怀牛膝、地龙组方治疗高血压的潜在靶点进行基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。以P<0.05且P-adjust<0.05为筛选条件,分别选取富集前20位的GO条目及KEGG通路。

2 结 果

2.1 杜仲、泽泻、黄芪、怀牛膝、地龙组方活性成分及其靶点 对杜仲、泽泻、黄芪、怀牛膝、地龙组方中每味中药的成分进行筛选后,获得杜仲活性成分28个、泽泻8个、黄芪18个、怀牛膝18个、地龙4个,部分活性成分结果见表1。剔除重复或者无固定结构信息的成分后,得到杜仲、泽泻、黄芪、怀牛膝、地龙组方的活性成分共70个,再将70个活性成分在TCMSP、SwissTargetPrediction、SEA数据库检索,获得杜仲、泽泻、黄芪、怀牛膝、地龙组方活性成分作用靶点共计1 222个。

表1 杜仲、泽泻、黄芪、怀牛膝、地龙药物活性成分及其特性

2.2 杜仲、泽泻、黄芪、怀牛膝、地龙组方治疗高血压潜在靶点 通过 OMIM、DrugBank及GeneCards 数据库总共收集获得高血压相关靶点2 126个。使用在线数据库Venny 2.1对高血压相关靶点及杜仲、泽泻、黄芪、怀牛膝、地龙组方活性成分1 222个作用靶点取交集,共得到432个杜仲、泽泻、黄芪、怀牛膝、地龙组方治疗高血压的潜在靶点。详见图1。

图1 杜仲、泽泻、黄芪、怀牛膝、地龙组方活性成分治疗高血压潜在靶点的韦恩图

2.3 杜仲、泽泻、黄芪、怀牛膝、地龙组方药物-成分-疾病靶点网络拓扑图 使用 Cytoscape构建“药物-成分-疾病靶点”网络图,运用Network Analyzer对所得网络图进行分析,计算网络中每个节点的度值,图中橙色代表疾病靶点,粉色、紫色、绿色、蓝色、橘色分别代表杜仲、泽泻、怀牛膝、黄芪、地龙药物及其有效成分,详见图2。网络中药物的同一活性成分可同时作用于多个靶点,而同一靶点可与多个药物成分对应,提示杜仲、泽泻、怀牛膝、黄芪、地龙组方对高血压治疗作用具有多成分、多靶点的协同特点。拓扑结果显示,“Degree”值较高的成分是槲皮素(quercetin,MOL000098)、山奈酚(kaempferol,MOL000422)、β-谷甾醇(β-sitosterol,MOL000358)、异鼠李素(isorhamnetin,MOL000354),为网络中的关键成分。

图2 “杜仲、泽泻、怀牛膝、黄芪、地龙药物-成分-高血压靶点”调控网络图

2.4 PPI构建及核心基因 将共同的潜在靶点导入STRING数据库,获取PPI相关信息,利用Cytoscape软件对PPI信息进行网络可视化(见图3),图中不同颜色及字体大小代表该靶点的作用强度,由深橙色至浅橙色、形状由大到小表示Degree值由高至低,此外,选择cytoHubba APP 对上述PPI网络中密度较高的区域进一步分析,筛选获得排名前10位的关键靶点为信号转导和转录激活因子3(STAT3)、类固醇受体辅助激活因子(SRC)、磷脂酰肌醇-3激酶调节亚基1(PIK3R1)、非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶11(PTPN11)、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基α(PIK3CA)、表皮生长因子受体(EGFR)、蛋白酪氨酸激酶2(PTK2)、丝裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、雌激素受体1(ESR1),并构建互作网络,节点颜色默认按度值由高至低(见图4,红色向黄色渐变),表明其可能是杜仲、泽泻、怀牛膝、黄芪、地龙药物组方治疗高血压的核心靶点。

图3 杜仲、泽泻、黄芪、怀牛膝、地龙组方活性成分治疗高血压靶点 PPI 网络

图4 关键靶点蛋白互作网络图

2.5 杜仲、泽泻、怀牛膝、黄芪、地龙药物治疗高血压相关KEGG通路富集分析 对杜仲、泽泻、怀牛膝、黄芪、地龙药物组方治疗高血压432个共同靶点进行KEGG通路富集分析,设置筛选条件P<0.01获得富集基因数量较多的代谢通路。在KEGG通路富集分析结果中包括190条重要通路,主要涉及癌症通路、糖尿病并发症中的糖基化终末产物及其受体(AGE-RAGE)信号通路、血流剪切应力与动脉粥样硬化、EGFR激酶抑制剂拮抗、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路等,对前20条通路进行可视化处理。详见图5。

图5 KEGG功能富集分析气泡图

2.6 GO富集分析 通过R软件对432个疾病-药物共同靶点进行分析,GO富集分析包括生物过程(biological process,BP)、细胞组分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)3部分。BP通路中交集基因主要与对含氧化合物反应、外源性刺激、对有机物质反应等生物学过程有关;CC主要与膜区、膜筏等有关;MF主要富集于小信号传递、离子结合、催化活性、酶结合等细胞功能。根据Count排序,对数据进行可视化处理。详见图6。

图6 GO富集分析结果

3 讨 论

中医因其“整体观念”“辨证论治”的特点及多靶点、多通路的优势,越来越得到专家的认可[9-10]。补肾和脉方在既往临床研究的基础上,以“肾气亏虚,血脉自病”新病机和“补肾气、和血脉”的新思路为基础,从高血压损害的发病机制入手进行组方,通过平补肾气、调和血脉实现了标本兼治、整体调节的高血压治疗策略[11]。方中的杜仲甘温,可补肾阳、强筋骨,具有补益元气、养血生血的黄芪可助真元,增加肾气;甘缓性平的怀牛膝配伍泽泻,具有利水渗湿、化痰降浊的功效;地龙可咸寒走下入肾,性善走窜,通行经络、清热结通利水道,合泽泻增强渗泻湿浊之功。上述几味中药作为补肾和脉方的核心药物,可共同发挥补肾益精、活血疏肝之功效。本研究利用网络药理学探讨上述5味核心中药治疗高血压的作用机制,筛选得到70种活性成分以及432个作用靶点,其中槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、异鼠李素等活性成分对应的靶点较多。槲皮素(3,3′,4′,5,7-五羟基黄酮)是一种低相对分子质量多酚类植物化学物质,自然界中多以槲皮素糖苷的形式存在[12]。既往研究显示,槲皮素可通过多途径发挥降压作用,也可通过抑制Toll样受体4(TLR4)/核转录因子κB(NF-κB)通路改善大鼠高血压,此外,槲皮素还可通过促血管内皮细胞自噬维持内皮功能发挥降压作用[13-14]。广泛分布于各种水果、蔬菜中的黄酮类化合物山奈酚,被证实具有抗炎、抗氧化、心血管保护作用,大量报道已证实山奈酚的血压调节作用,有研究显示,山奈酚对血管舒张调节与一氧化氮(NO)-环磷酸鸟苷(cGMP)-蛋白激酶G(PKG)信号通路有关[15]。山奈酚可通过抑制氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)形成、降低巨噬细胞对ox-LDL摄取,从而预防动脉粥样硬化发生;此外,山奈酚还具有抗心肌细胞氧化和凋亡作用,该过程与其调控TLR4/NF-κB和蛋白激酶B(Akt)/叉头盒O类转录因子-3a(FoxO3a)信号有关[16]。β-谷甾醇属于四环三萜类化合物,作为一种化学结构与哺乳动物胆固醇高度类似的植物类固醇,不仅可通过抗氧化和抗炎途径发挥降压作用,还能直接影响血管平滑肌功能,促进血管扩张,降低外周血管阻力调节血压[17]。

本研究通过 PPI 拓扑分析发现,STAT3、SRC、PIK3R1、PTPN11、PIK3CA、EGFR、PTK2、MAPK3、VEGFA、ESR1等可能是补肾和脉方核心中药治疗高血压的关键靶点。表皮细胞生长因子(EGF)及VEGFA均为生长因子,其中EGFR是一种受体型蛋白酪氨酸激酶,广泛表达于包括心脏和血管的正常组织,是调控许多基本的细胞生物过程(如分化、增殖、迁移等)的重要因子,有研究证实,EGFR与继发性高血压诱发的心肌肥大和血管平滑肌细胞增殖密切相关[18]。VEGFA作为血管内皮活性维持的重要调控因子,研究显示,高血压病变进程可伴随血管内皮细胞VEGFA表达上调,并证实过量的VEGFA可通过诱发局部微循环中的内皮细胞过度分裂增殖,引起内皮功能受损[19];STAT3、SRC、PIK3R1、PTPN11、PIK3CA、PTK2、MAPK3作为多种调控因子共用的重要信号转导通路,可参与细胞生长、增殖、分化、凋亡等多个生物学过程,既往研究证实其可通过影响氧化应激状态、炎症水平、血管内皮细胞功能、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)等多种途径参与高血压病变进程[20-22]。

在GO和KEGG分析中,补肾和脉方核心中药治疗高血压的靶点功能主要有AGE-RAGE信号通路、血流剪切应力与动脉粥样硬化、EGFR激酶抑制剂拮抗、MAPK信号通路等。血管钙化作为高血压重要的病理基础和危险因素之一,研究显示,AGE-RAGE信号通路可通过调控自噬、上调ENPP1表达等途径影响血管平滑肌细胞功能参与血管钙化过程[23]。MAPKs是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,存在着多条并行信号通路,包括p38-MAPK、细胞外调节蛋白激酶(ERK)和c-Jun氨基末端激酶(JNK),目前MAPK信号通路改变对心血管疾病发生发展的影响作用已获得普遍认可。结合GO分析结果及拓扑的核心靶点,推测补肾和脉方的核心中药治疗高血压的潜在机制主要涉及抗炎、RAAS系统、钙离子拮抗剂作用、舒张血管及改善内皮功能等方面。

本研究借助网络药理学,对补肾和脉方中5味核心中药治疗高血压的分子机制进行了初步探讨,明确了槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、异鼠李素等活性成分可能通过减少氧化应激、抗炎症反应、抑制细胞损伤、减少细胞凋亡等途径实现对高血压的改善作用,揭示了补肾和脉方中5味核心中药可通过多成分、多途径、多靶点实现对高血压的协同治疗作用。