全自动固相萃取-高效液相色谱法测定食品中红曲色素

2023-06-08王思媛段鹏雪

食品安全导刊 2023年10期

王思媛，段鹏雪

（庆阳市疾病预防控制中心，甘肃庆阳 745000）

红曲色素产生于红曲霉菌的代谢过程，是一类聚酮体化合物的混合物质，红曲色素在食品生产领域的应用相当广泛[1-2]。《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）中规定，红曲色素作为食品着色剂应用于酒、熟肉制品、糖果和腐乳中时可按需添加[3]。

高效液相色谱-质谱联用法[4-5]、高效液相色谱法[6]、分光光度法[7]和近红外光谱法[8]等检测方法已成为分析红曲色素的主要手段，其中高效液相色谱法是检测红曲色素最常使用的方法。本文利用全自动固相萃取技术对样品完成净化，采用高效液相色谱法进行检测分析，建立了食品中红曲素、红曲红素、红曲红胺定性定量的分析方法，为食品中的红曲色素成分的快速检测提供了实践参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器（DAD）；Reeko Fotector-06c全自动固相萃取仪；高速冷冻离心机；Milli-Q超纯水系统；HLB型固相萃取柱（200 mg/6 mL）；SB5200DTDN超声波仪；Flex-MVP全自动真空浓缩仪。

标准品：红曲素（98.9%）、红曲红素（98.0%），红曲红胺（98.3%）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯；实验用水为超纯水。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：40 ℃；红曲红素、红曲素检测时波长设定为390 nm；红曲红胺检测时波长设定为264 nm；进样量20 μL；流速1.0 mL·min-1。流动相为甲醇-乙酸铵溶液（pH=5），流动相比例和梯度洗脱见表1。

表1 流动相比例和梯度洗脱

1.2.2 溶液配制

（1）单标准储备溶液的配制。称取红曲素5 mg、红曲红素100 mg、红曲红胺10 mg，分别用甲醇定容至100 mL、20 mL、100 mL。其中红曲素质量浓度为50 μg·mL-1、红曲红素为5000 μg·mL-1、红曲红胺为100 μg·mL-1，于4 ℃条件下冷藏保存。

（2）混合标准工作液的配制。分别吸取上述标准储备液0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、5.00 mL和10.00 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇定容，于4 ℃保存。混合工作液质量浓度分别为红曲红胺2 mg·L-1、4 mg·L-1、8 mg·L-1、20 mg·L-1、40 mg·L-1，红曲素1 mg·L-1、2 mg·L-1、4 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-1，红曲红素100 mg·L-1、200 mg·L-1、400 mg·L-1、1000 mg·L-1、2000 mg·L-1。

1.2.3 提取

分别称取醋、酱油、料酒、冷冻饮品、调制乳等液体样品5.00 g置于烧杯中，用无水乙醇进行溶解后，定容至50 mL，待净化。

分别称取熟肉制品、腌制蔬菜、调味品、膨化食品、发酵乳和炼乳等固体半固体样品5.00 g置于50 mL离心管中，用20 mL 80%的乙醇溶液涡旋混匀后，超声提取15 min，在4 ℃条件下，于4500 r·min-1离心5 min，取上清液，并用20 mL 80%的乙醇溶液复提1次，将两次提取液合并于50 mL容量瓶中，用无水乙醇定容，待净化。

1.2.4 净化

取1.2.3项下合并后的提取液20 mL于50 mL离心管内，并加入乙醇10 mL，在（60±2）℃下，真空浓缩达到近干状态，用2 mL 20%的甲醇溶解残渣2次，将其全部转移至10 mL进样瓶中，用全自动固相萃取仪净化富集，程序见表2。收集的洗脱液进行真空浓缩近干后，用2 mL 20%的甲醇溶解，待测液过0.45 μm有机滤膜后，进行测定。

表2 净化富集程序

2 结果与分析

2.1 色谱分离效果

按照上述实验方法对红曲素10 mg·L-1、红曲红素2000 mg·L-1、红曲红胺20 mg·L-1的混合标准溶液进行实测。由图1可知，在264 nm波长下红曲红胺的出峰时间为9.599 min，在390 nm波长下红曲素和红曲红素出峰时间依次为10.862 min、11.502 min。

图1 红曲色素混合标准溶液色谱图

2.2 色谱柱的选择

红曲素、红曲红素和红曲红胺均为弱极性物质，在C18色谱柱上都有较好的保留，因红曲素、红曲红素和红曲红胺的化学结构具有相似特征，因此出峰时间较为相近。本试验选用C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱进行检测，通过调整流动相比例和梯度洗脱，使红曲素、红曲红素和红曲红胺可以完全分离。

2.3 流动相选择

用于分离红曲类色素的流动相有磷酸溶液pH=2.5±0.3和乙腈[6]、乙腈和水[4]、甲醇和1%乙酸[9]、甲醇和乙酸铵（pH=5）[10]等。试验发现，以上4种流动相中甲醇和乙酸铵（pH=5）能够较好地分离出红曲红胺、红曲素和红曲红素。同时试验采用的梯度洗脱程序用时18 min与《食品安全国家标准食品中红曲色素的测定》（GB 5009.150—2016）用时30 min相比，检测样品所需时间更短，更适合批量检测。

2.4 标准曲线和检出限

根据3倍信噪比（3S/N）计算检出限[11]，红曲素、红曲红素和红曲红胺的检出限分别为0.146 mg·kg-1、5.770 mg·kg-1、1.880 mg·kg-1，均低于GB 5009.150—2016中规定的检出限要求（红曲素0.30 mg·kg-1、红曲红素30 mg·kg-1和红曲红胺3.0 mg·kg-1），满足分析要求。

将1.2.2配制成的混合标准曲线工作液，依照色谱要求完成检测，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。由表3可知，红曲素、红曲红素和红曲红胺的线性方程相关系数均在0.999以上，且线性关系良好。