CRISPR/Cas9技术在卵巢癌转移中的研究进展

朱姣姣 魏林珍 陈凡 丁瑶瑶 张倩倩 秦天生

[摘要] 由成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及其相关蛋白9（CRISPR associated nuclease，Cas9）介导的基因编辑技术已被广泛用于探究癌症相关基因的功能、建立癌症动物模型和探测物药靶点，是一种高效、快速和位点特异性的工具。近年来，卵巢癌发病率逐年增加，严重威胁女性健康。目前多采用手术、放疗、化疗或联合治疗等方法延缓疾病的进展，但效果不佳，是临床迫切需要解决的一大问题。因此，利用CRISPR/Cas9技术靶向致病基因、筛选相关功能基因及寻找新的药物靶点为卵巢癌的治疗带来了希望。本研究对既往CRISPR/Cas9技术在卵巢癌转移中的研究应用进行综述，希望对该领域未来的研究奠定理论基础，也为肿瘤特别是卵巢癌的治疗提供新的参考。

[关键词] CRISPR/Cas9；基因编辑；卵巢癌；转移

[中图分类号] R737      [文献标识码] A      [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2023.11.027

CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated）系统是细菌和古细菌抵抗外源入侵的防御系统。2012年有研究发现其能在体外切割双链DNA[1]，从而开启了基因编辑技术的新格局，成为当前最热门的基因编辑技术，并于2020年获得诺贝尔化学奖[2]。与其他基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9技术操作流程简单，成本低、效率高。近年来被越来越多的用于基因定点编辑、基因组筛选、建立疾病动物模型和筛选药靶点等，为疾病的诊疗提供了新的选择。

卵巢癌是一種具有高度转移性的恶性肿瘤，早期症状不明显，大多数患者在就诊初期已发现腹腔播散等转移情况，目前与卵巢癌转移相关的基因组学仍不清楚，患者的治疗选择有限，且耐药机制在很大程度上导致治疗现状并不乐观。随着技术的发展，CRISPR/Cas9技术为肿瘤的治疗带来了新的可能性。因此，本文对既往CRISPR/Cas9技术在卵巢癌转移中的研究进展进行综述，便于有关卵巢癌转移的后续研究。

1  CRISPR/Cas9概述及作用机制

原核生物为抵御噬菌体或病毒及外源质粒DNA侵袭进化出一种适应性免疫防御系统，称为成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）。1987年，日本学者对一段大肠杆菌染色体进行测序，发现了一段由重复片段和非重复片段间隔连接的保守短序列[3]。Jansen等[4]在2002年介绍了一组基因组的存在，被命名为CRISPR，且该系统由CRISPR和一系列相关蛋白Cas（CRISPR-associated proteins，Cas）共同组成。2007年，有学者证明CRISPR系统是一种具有预防作用的免疫系统[5]，这是原核生物CRISPR系统具有适应性的实验证据。2008年，Shen等[6]发现，在CRISPR序列中，前间隔序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM）有着重要作用。2013年，有研究发现Ⅱ型CRISPR/Cas系统实现了对哺乳动物细胞内源性基因组位点的精确编辑[7]。2016年，CRISPR/Cas9基因编辑工具首次应用于临床[8]。此后，许多基于CRISPR/Cas9的基因编辑方法出现，极大地提高了基因组编辑的精度，并扩大了其应用范围。

目前，CRISPR/Cas系统可Class1和Class2两类，根据效应蛋白的结构和功能又分不同的亚型，Class1包括Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型，Class2包括Ⅱ型、Ⅴ型、Ⅵ型，其中Ⅱ型CRISPR/Cas9系统构成简单，主要由内切酶（Cas9）、CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）3部分组成，是目前应用最广的基因编辑方法。

作为原核生物的免疫防御系统，CRISPR主要通过3个步骤发挥作用。①当噬菌体或病毒首次感染细菌时，将自身遗传物质导入菌体，菌体中的CRISPR系统将入侵病毒基因组DNA序列前间隔序列，整合到自身的CRISPR阵列，成为间隔序列邻近基序（proto-spacer-adjacent motifs，PAM）。②当噬菌体或病毒再次感染细菌时，该外源片段被转录加工为成熟的crRNA并与Cas蛋白结合。③crRNA与外源病毒基因组DNA或RNA通过碱基互补配对引导Cas蛋白对其切割。断裂的双链启动自身修复机制修复，如非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）和同源重组修复（homology dependent repair，HDR）机制，前者在没有修复模板的情况下使用非同源DNA修复途径，DNA末端被重新连接，通常导致引入小的插入或删除而导致突变；HDR可机制利用同源模板与断裂的双链末端形成互补，使末端被连接，以实现基因敲除或精确基因的插入。

2  CRISPR/Cas9在癌症中的应用

近年来，随着对基因编辑技术的深入研究，CRISPR/Cas9不断地被用于敲除肿瘤致病基因、建立肿瘤基因编辑模型、打破机体免疫耐受、基因治疗、联合文库筛选功能基因及耐药靶点、表观遗传学等方面的研究。

2.1  敲除肿瘤致病基因

编辑癌基因、抑制特定蛋白表达，是研究肿瘤形成、发展和治疗过程的关键策略。Olaizola等[9]研究拟泛素化修饰在胆管癌发生、发展中的作用，利用CRISPR/Cas9介导的NAE1基因敲除，在体外和体内模拟胆管癌中的NAE1抑制剂的效应。Chou等[10]研究信号转导和转录激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）在结直肠癌肿瘤生长中的作用，利用CRISPR/Cas9系统分别在结直肠癌细胞系及异种移植小鼠模型中敲除STAT1，发现STAT1敲除可降低细胞的生长，证实STAT1在结直肠癌中的致癌作用。转录因子MondoA与癌细胞代谢应激有关，利用CRISPR/Cas9和RNA干扰等技术，Sipol等[11]研究结果显示，MondoA耗尽可在体外降低急性B淋巴细胞白血病细胞的转化能力，并在体内小鼠模型中显著抑制了恶性潜能。细胞甲酸结合蛋白Ⅱ（cellular retinoic acid binding protein 2，CRABP-Ⅱ），在所有胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）中都过表达，采用CRISPR/Cas9基因编辑方法建立CRABP-Ⅱ基因敲除细胞系，并评估吉西他滨的体外敏感性，发现CRABP-Ⅱ缺失使PDAC细胞对吉西他滨诱导的细胞凋亡敏感，为克服PDAC耐药提供了一个新的选择[12]。Chen等[13]将放疗技术与CRISPR/Cas9基因敲除相结合阻断巨噬细胞免疫检查点通路CD47-SIRPα，提高荷瘤小鼠的生存率，降低肿瘤干细胞，改善预后，为胶质母细胞瘤的治疗提供了新的思路。

2.2  表观遗传

癌症是由遗传和表观遗传共同引起的。CRISPR/Cas9被用于识别可能在肿瘤发生及治疗耐药机制中发挥作用的异常遗传和表观遗传，例如近期在前列腺癌中的研究[14]。将CRISPR/Cas9技术与下一代测序（next-generation sequencing，NGS）相结合，可能加快目标位点的识别、验证和定位。NGS诊断结果可作为CRISPR/Cas9工具编辑突变基因的基础[15]。采用CRISPR/Cas9诱导染色体整体重排可以重塑人类细胞的基因组和转录组，为表观遗传和细胞基因表达的研究提供参考[16]。Wang等[17]通过CRISPR/Cas9文库进行筛选，结合细胞水平及临床样本的验证，确定了低表达的肝癌源性生长因子2与多发性骨髓瘤细胞对蛋白酶体抑制剂类药物的低敏感度密切相关。这为CRISPR/Cas9技术在表观遗传学中的研究提供了理论基础与实验依据。

2.3  基因治疗

CRISPR/Cas9技术因其高效的编辑效率及靶向不同的靶点等优势，已被用于肿瘤、造血系统疾病，以及联合免疫疗法用于肿瘤免疫等疾病的基因治疗。Kwon等[18]开发了一种名为CINDELA（cancer-specific indel attacker）的腫瘤疗法，利用CRISPR/Cas9靶向癌症特异性插入或缺失（insertions and deletions，InDel）突变，导致多处发生DNA双链断裂，从而实现对肿瘤细胞的特异性杀伤。在基于T细胞的免疫疗法中，CRISPR/Cas9技术的应用正在探索中，以改善T细胞效应的功能和持久性，减少治疗相关毒性。Stadtmauer等[19]在Ⅰ期临床试验中研究了多重CRISPR/Cas9编辑的安全性和可行性，以提高3名患有多发性骨髓瘤和转移性肉瘤患者的人类T细胞的天然抗癌能力，证明CRISPR基因编辑用于癌症免疫治疗的可行性。嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（chimeric antigen receptor T-Cell immunotherapy，CAR-T）的临床疗效已经在人类癌症中得到证实，基于CRISPR/Cas9的基因组编辑的CAR-T细胞技术，为肿瘤免疫相关研究提供了参考，如利用CRISPR/ Cas9筛选将NOXA鉴定为B细胞恶性肿瘤对嵌合抗原受体CAR-T细胞疗法耐药的关键调节因子[20]。

2.4  全基因组筛选

目前，基于CRISPR/Cas9的全基因组筛选方式利用基因组规模的sgRNA文库在人或小鼠细胞中进行基因敲除筛选，已经筛选到了一系列潜在的治疗靶点、功能基因以及与药物协同作用产生耐药性的基因为创新癌症疗法开辟了新的前景。

为识别伯基特淋巴瘤（Burkitt lymphoma，BL）中的缺陷和肿瘤抑制因子，对3个BL细胞系进行全基因组CRISPR/Cas9功能缺失筛选，确定SHMT2为治疗靶点[21]。通过全基因组CRISPR/Cas9筛选发现蛋白精氨酸甲基转移酶1（protein arginine methyltransferase 1，PRMT1）是前列腺癌中雄激素受体表达及信号传导的关键调节因子[22]。CRISPR/Cas9的全基因组筛已被广泛用于急性髓性白血病（acute myelogenous leukemia，AML）筛选治疗靶点[23]，但既往大多在体外细胞系中开展相关研究，往往忽略了体内微环境对靶点筛选的影响。在代表不同分子亚型的多个小细胞肺癌（small cell lung carcinoma，SCLC）细胞系中，利用1个针对已知药物靶标基因的sgRNA文库进行CRISPR/Cas9筛选，确定核输出蛋白1作为SCLC的一个新治疗靶点，抑制它可以显著提高肿瘤对一线和二线化疗的敏感性[24]。结合生物信息学，利用CRISPR/Cas9敲除文库筛选功能基因，最终富集了一批可能影响三阴乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）转移的候选基因，并表明DGKZ基因是TNBC潜在的促转移基因[25]。

未识别亚型的肝细胞癌患者适于二甲双胍治疗，Feng等[26]采用CRISPR/Cas9文库筛选发现DOCK1的缺失可增强肝细胞癌细胞对二甲双胍的敏感性，并利用细胞、类器官、小鼠原位肝细胞癌等多种模型等方法验证了DOCK1水平，决定二甲双胍的抗肿瘤作用。DOCK1是二甲双胍在HCC中的合成致死靶点，为二甲双胍在肝细胞癌中的精准应用提供了理论依据。基于CRISPR/Cas9的筛选系统可用于识别与抗癌药物疗效相关的基因，Chen等[27]通过一系列CRISPR/Cas9库筛选、RNA转录组测序技术和代谢组学分析发现，硒半胱氨酸生物合成的关键中间物是肝细胞癌细胞对化疗耐药的关键介质。

2.5  构建癌症动物模型

当前CRISPR/Cas9技术已被运用于建立各种小鼠癌症模型，如胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌、卵巢癌等。小鼠模型在评估肿瘤进展和治疗反应方面有独特优势。肿瘤细胞异位移植是评估靶细胞系体内致瘤潜能最简单的方法，将细胞植入免疫缺陷小鼠皮肤下，评估肿瘤增殖、治疗等反应。Loesch等[28]通过使用Cre-Lox或腺相关病毒载体介导的CRISPR/Cas9方法生成肝细胞特异性和可诱导小鼠模型，但异位移植模型不能很好地反应肿瘤微环境以及复杂的免疫细胞调控等。Qin等[29]使用全基因CRISPR/Cas9基因敲除，筛选在小鼠原位模型中调节卵巢癌腹膜扩散的候选基因。Guo等[30]为研究SF3B1R625H突变在泌乳素瘤进展中的生物学作用，使用CRISPR/Cas9基因编辑系统获得了一个杂合的Sf3b1R625H突变大鼠细胞系。建立癌症小鼠在了解癌症的发生和进展方面是必要的，这些模型可以在体内研究基因功能并阐明参与肿瘤发生的途径。

3  CRISPR/Cas9在卵巢癌转移中的应用

对于已出现转移的卵巢癌患者，化疗、靶向治疗等的临床效果有限，晚期患者的5年生存率较低。目前对于卵巢癌转移和化疗耐药的分子机制尚不清楚，因此利用CRISPR/Cas9技术寻找新的靶点、耐药基因或建立卵巢癌转移模型，对早期诊断和开发新药改善卵巢癌治疗具有重要意义。Xu等[31]利用CRISPR/Cas9全基因组敲除文库成功构建小鼠卵巢癌转移模型，通过筛选提示细胞毒性淋巴细胞相关基因ITK预测卵巢癌远处转移患者的预后。同样，Li等[32]为系统识别卵巢癌腹膜转移调控的关键基因，利用CRISPR/Cas9基因敲除文库对原位卵巢癌鼠模型进行全基因组基因敲除筛选，发现白细胞介素20受体亚基α在卵巢癌腹膜转移过程中显著下降，是卵巢癌经体腔转移的有效抑制剂。

在研究转移机制方面，Zhang等[33]使用全基因组CRISPR/Cas9技术对可能参与卵巢癌转移和失巢凋亡抗性的基因进行全面筛选，发现蛋白质-L-异天冬氨酸（D-天冬氨酸）O-甲基转移酶与卵巢癌的失巢凋亡抗性的相关性最高，是卵巢癌转移的关键驱动因子。

在肿瘤进展过程中，有多种因素参与了上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程。EMT有助于肿瘤转移和促进化疗耐药性，但卵巢癌中调节EMT过程的机制尚不清楚。Yin等[34]使用CRISPR/Cas9技术敲除过表达TNNC1的SKOV-3-13卵巢癌细胞中的TNNC1基因，可抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭，同时TNNC1缺陷细胞通过Akt/GSK-3β/Snail信号通路抑制EMT，并通过抑制F-肌动蛋白聚合抑制细胞运动。EIF5A2在几种癌症中具有致癌活性并有助于肿瘤转移，为研究其在肿瘤中的作用，使用基于慢病毒载体介导的的 CRISPR/Cas9技术及过表达方法，证明EIF5A2通过TGFβ通路促进EMT，从而控制卵巢肿瘤的生长和转移[35]。Liu等[36]使用CRISPR/Cas9技术敲除AMIGO2表达，对体外和体内功能进行分析。AMIGO2的敲除改变了卵巢癌细胞的微球形成潜力，减少了体外黏附和侵袭，并显著减弱了腹膜内转移，强调AMIGO2是抗转移治疗方法的新靶点，旨在阻断转移性肿瘤球的凝聚力、存活和黏附。网膜是卵巢癌细胞的首选转移部位，大多数被诊断患有高级别浆液性卵巢癌的女性存在网膜转移。为证明网膜巨噬细胞通过分泌与趋化因子受体1（CC chemokine receptor 1，CCR1）相互作用的趋化因子配体可促进卵巢癌细胞向网膜的迁移和定植，Krishnan等[37]利用CRISPR/Cas9技术发现抑制CCR可减少卵巢癌的定植。以上研究结果均有助于更好地理解导致卵巢癌转移的分子机制。

4  小结

综上所述，卵巢癌转移是多步骤并具有高度选择性的过程，包括肿瘤细胞从原发灶分离、非锚定生长、凋亡逃逸、细胞迁移、周围组织浸润等。CRISPR/Cas9技术作为精准的基因治疗方法，靶向癌细胞的多个位点或特异性突变序列，使肿瘤特异性治疗成为可能，对卵巢癌转移的后续研究临床意义重大，为未来的相关研究提供了新的思考与帮助。

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