胎儿游离DNA浓度低相关因素分析及其对不良妊娠结局的影响

冯传欣 邹永毅 阳彦 刘艳秋*

（江西省妇幼保健院医学遗传中心江西省出生缺陷防控重点实验室，江西南昌，330006）

母体血浆中胎儿游离DNA（cell-free fetal DNA，cff DNA）的发现以及高通量测序技术的快速发展，使得胎儿染色体异常的无创检测成为可能［1］，这种方法被称为无创产前筛查（non-invasive prenatal screening，NIPS）。目前NIPS已经广泛应用于胎儿染色体非整倍体的筛查，对三种常见非整倍体21三体（T21）、18三体（T18）和13三体（T13）的检出率分别为99%、96%和91%，总体假阳性率小于1%［2］。cff DNA主要来源于胎盘成熟和衰老过程中滋养细胞的凋亡或坏死。在孕5周时便可在母体血浆中检测到cffDNA，其含量随着孕周的增加而增加。cff DNA浓度是指母体血浆中胎儿游离DNA占总的游离DNA的比例，在孕10～20周之间约为10%～15%［3，4］。cffDNA浓度低（＜4%）会因为相对高浓度的母体游离DNA而影响NIPS结果的准确性，导致检测失败。Gil等［5］统计发现由cffDNA浓度低导致的NIPS检测失败率为0.1%～6.1%。多种因素会影响cffDNA浓度，如胎盘的大小和功能、孕妇体重和孕周［6］。到目前为止已有大量研究对cffDNA浓度影响因素进行了分析，但尚未达成广泛的共识。因此，有必要对影响cffDNA浓度的相关因素进行分析总结。此外，cffDNA主要来源于胎盘，cffDNA浓度低可能反映了较小的胎盘质量以及胎盘功能障碍。有研究发现cffDNA浓度异常变化可能预示不良妊娠结局，例如妊娠高血压、子痫前期、胎儿生长受限、早产等［7，8］。探讨cffDNA浓度与不良妊娠结局的关系，对妊娠并发症的早期筛查具有潜在意义。本文旨在分析总结cff DNA浓度低相关因素及其对不良妊娠结局的影响。

1 影响cffDNA浓度的因素

NIPS检测中来自母体的游离DNA片段和来自胎儿的游离DNA片段无法被真正分离，了解cffDNA浓度才能准确判读结果，因此cff DNA浓度是分析NIPS结果的一个重要参数。cffDNA浓度存在很大的个体间差异，任何影响游离DNA来源的因素都可能影响cffDNA浓度。不同的因素对cffDNA浓度的影响不一样，例如cffDNA浓度随孕周增加而增加，随母亲体重增加而降低［6］。目前已知一些母体因素和胎儿胎盘因素会影响cffDNA浓度。

1.1 母体因素 孕妇体重或体重指数（BMI）是影响cff DNA浓度的重要因素。大量研究发现cffDNA浓度与孕妇体重或体重指数（BMI）之间呈负相关。Ashoor等［9］发现cffDNA浓度的平均值从孕妇体重60kg时的12%下降到120kg时的6%，表明cff DNA浓度随着孕妇体重的增加而下降。Hou等［10］研究显示与＜18.5kg／m2组（14.54%）相比，18.5～24.9kg／m2组（13.37%）、25～29.9kg／m2组（12.20%）、30～34.9kg／m2组（11.32%）和35～39.9kg／m2组（11.57%）的cffDNA浓度显著降低（P＜0.01），cffDNA浓度随着孕妇BMI的增加而下降，这与另一项回顾性研究［11］结果一致。其原因可能是孕妇体重增大导致血容量增加，从而稀释了血浆中cffDNA。此外，肥胖孕妇的脂肪组织通过脂肪细胞坏死或基底层的血管组织凋亡进行活跃的脂肪重建增加了血浆中母体来源的游离DNA，导致cff DNA浓度降低［12］。鉴于孕妇体重或BMI对cff DNA浓度的影响，我国孕妇外周血游离DNA产前筛查与诊断技术规范将重度肥胖（BMI＞40kg／m2）孕妇列入慎用人群。

孕妇年龄是否影响cffDNA浓度目前还存在争议。Hou等［10］通过分析统计不同年龄组孕妇的cff DNA的浓度，发现cffDNA浓度随孕妇年龄的增加而降低。Guo［13］等也发现cffDNA浓度与孕妇年龄之间存在负相关。可能的原因是孕妇随着年龄的增加生理机制也有很大变化，如体重增加、细胞凋亡增加等，导致cffDNA浓度降低。然而，也有研究表明cffDNA浓度与孕妇年龄之间没有相关性［14］。因此，孕妇年龄对cffDNA浓度的影响尚未达成共识，还需要更多的数据进行进一步的研究。

Grömminger等［15］首先报道了使用低分子肝素（LMWH）与NIPS检测失败之间关系，通过回顾12例检测失败孕妇的用药史发现其中9例正在接受低分子肝素治疗。Burns等研究发现［16］cffDNA浓度低导致的NIPS检测失败与孕妇使用低分子肝素或依诺肝素有关。肝素可以通过减少细胞角蛋白新表位、核小体DNA形成以及E-钙粘蛋白表达等机制来减少滋养层细胞凋亡并提高滋养层细胞存活［17，18］。因此，抑制胎盘滋养层细胞凋亡可能是肝素导致cffDNA浓度下降的机制。此外，其他一些药物的使用也可能影响cffDNA浓度。Maggie等［19］发现服用二甲双胍会导致cffDNA浓度降低，服用两种或两种以上药物组的cffDNA浓度明显低于未服用任何药物组。Joshua等［20］发现低剂量阿司匹林的使用会增加NIPS检测失败率，但是阿司匹林的影响小于肝素。然而，一项纳入9867例单胎妊娠孕妇的研究［21］表明肝素治疗对NIPS检测没有影响，自身免疫性疾病才是检测失败的独立预测因素。Hui［22］等报道了一名患有严重自身免疫性血小板减少症及自身免疫性中性粒细胞减少症的孕妇由于cffDNA浓度低导致多次NIPS检测失败。Chan等［23］对系统性红斑狼疮患者血浆DNA生物学特征分析发现了大量的血浆DNA异常，这些异常血浆DNA可能会干扰cffDNA，从而影响NIPS的检出率。此外，其他的母体疾病，如严重的β-血红蛋白病，也会引起cffDNA浓度低从而导致检测失败［24］。

辅助生殖妊娠也可能影响cffDNA浓度。一项包含自然妊娠和体外受精（IVF）妊娠的回顾性研究［25］发现IVF妊娠cffDNA浓度中位数显著低于自然妊娠，这与Chen［26］等的结果一致。可能原因包括：①IVF妊娠过程中的激素治疗或胎盘受损可能影响了cffDNA的产生［25］；②IVF妊娠孕妇炎症和内皮损伤的增加使得母体来源的游离DNA增加导致cffDNA浓度相对降低［27］。然而，也有研究发现不一致的结果，IVF妊娠和自然妊娠表现出相似水平的游离DNA，两组之间的cffDNA浓度没有显著差异［28，29］。辅助生殖妊娠对cffDNA浓度的影响仍需进一步分析。

1.2 胎儿胎盘因素 采血时的孕周与cffDNA浓度呈正相关。Wang等［6］研究表明cffDNA浓度与孕周成正比，cffDNA浓度从孕10周至21周总共增加了1%，而孕21周后每周增加1%。Kinnings等［30］也发现cffDNA浓度在孕12.5～20周期间每周增加0.083%，而在孕20周后每周增加0.821%，表明cffDNA浓度随孕周增加而增加，且增加的幅度在不同孕周有所不同。以上研究均表明孕周与cffDNA浓度呈强正相关，可能的原因是随着孕周的增加胎盘体积也逐渐增大，凋亡的滋养层细胞增多，因此更多的胎儿游离DNA片段释放到孕妇血浆中，导致cffDNA浓度增加。

随着促排卵药物以及辅助生殖技术的应用，双胎妊娠比例逐渐增高。研究显示双胎妊娠NIPS检测失败率高于单胎妊娠［31］。Gil等［32］研究发现双胎妊娠cffDNA浓度中位数低于单胎妊娠，可能是导致双胎妊娠孕妇检测失败率更高的原因之一。Hedriana等［33］研究表明双胎妊娠总cffDNA浓度比单胎妊娠高32%，其中双绒毛膜妊娠和单绒毛膜妊娠总cff DNA浓度分别比单胎高35%和26%，但是双绒毛膜妊娠中每个胎儿的cffDNA浓度平均比单胎低32%。双绒毛膜妊娠每个胎儿释放到母体循环中的cffDNA数量不同，其差异可能接近两倍［34］。NIPS在双胎妊娠中筛查时为了避免假阴性结果，会选择双胎中cffDNA浓度较低的一个而不是总的cffDNA进行非整倍体风险评估［35］。因此，双绒毛膜妊娠在NIPS检测中更容易检测失败。

研究发现NIPS检测失败与细胞遗传学异常风险增加有关［36］。Norton等［37］研究发现NIPS检测失败（cffDNA浓度低于4%）的群体中非整倍体的发生率为4.7%，相比之下整个队列人群中的非整倍体的发生率仅为0.4%。不同类型胎儿染色体非整倍体对cff DNA浓度的影响不一样。cffDNA浓度在18三体组和13三体组中明显低于整倍体组，而在21三体组中高于整倍体组［38］，这可能是临床上T21筛查效果更佳的原因之一。Becking等［39］发现NIPS检测中的cffDNA浓度低与胎儿13三体、18三体、X单体和三倍体的风险增加有关。胎盘质量低、胎盘病理性改变等可能解释了这些染色体非整倍体与cffDNA浓度低之间的相关性［40，41］。因此，对于因cffDNA浓度低导致的检测失败的群体有必要提供遗传咨询并完善产前诊断。

2 cff DNA浓度与不良妊娠结局的关系

cffDNA主要来源于胎盘，母体循环中cffDNA浓度可以反映胎盘的健康和功能。胎盘的一些病理性变化如胎盘炎性因子的释放或胎盘血管异常导致胎盘灌注不足等，可导致妊娠并发症的发生［42］。因此，cffDNA浓度有可能成为预测不良妊娠结局的重要参数。已经有研究表明cffDNA浓度异常与不良妊娠结局相关，如妊娠高血压、子痫前期、胎儿生长受限、早产等［43］。

研究发现cffDNA浓度低与妊娠期高血压和重度子痫前期相关［7］。Becking等［43］发现，由于cff DNA浓度低而导致NIPS检测失败的女性中妊娠期高血压和子痫前期的发生率较普通人群偏高，与之前Suzumori［44］以及Rolnik等［45］的研究结果一致。妊娠高血压常伴有肥胖或高BMI，在分析cffDNA浓度低与妊娠期高血压的关系时需要考虑BMI带来的影响。随后Deeksha等［46］在排除了孕妇BMI影响后，仍发现较低的cffDNA浓度和妊娠期高血压之间存在相关性。

胎盘功能障碍是胎儿生长受限的主要原因，推测胎儿生长受限可能受异常cffDNA浓度的影响。Clapp［47］等研究发现cffDNA浓度低与出生体重低于第10和第5个百分位数有关，表明cffDNA浓度低与胎儿生长受限风险增加相关。Yuan等［48］也发现cffDNA浓度低（低于第5百分位）与低出生体重婴儿的风险增加有关（＜2500g）。然而，也有一些研究显示cffDNA浓度与胎儿生长受限之间没有相关性［8，46］。因此还需要更多的研究来确定两者是否存在相关性。

早产是一种具有多种病因和表型特征的综合征。Krishna等［8］研究发现，cffDNA浓度低的孕妇与cffDNA浓度正常的孕妇早产的发生率有显著差异，其中40.9%的cffDNA浓度低的孕妇早产。Yuan等［48］也发现cffDNA浓度低（低于第10百分位）与早期早产（小于34周）风险增高相关。然而这两项研究没有区分自发性早产和具有医学指征（高血压等）的早产。Gerson等［7］在排除了具有医学指征的孕妇后发现cffDNA浓度与早产之间没有相关性。此外，目前的研究表明其他一些妊娠并发症，如胎盘早剥［8］、胎盘增生和前置胎盘［44］、妊娠肝内胆汁淤积［48］和妊娠期糖尿病［49］等暂未发现与cff DNA浓度之间存在相关性。

综上所述，cffDNA受多种因素的影响，其中孕妇体重和孕周对cffDNA浓度的影响基本明确，孕妇体重越大、孕周越小，cffDNA浓度越低。母体疾病或药物治疗也是影响cffDNA浓度的重要因素，采血前避免使用肝素等药物。双胎和辅助生殖妊娠可能会降低cffDNA浓度，可以适当推迟采血时间以确保结果的准确性。cffDNA浓度低导致的检测失败人群中胎儿非整倍体风险更高，所以建议对检测失败的人群提供遗传咨询并完善产前诊断。cff DNA水平还与妊娠并发症相关，如妊娠高血压和子痫前期，两者关系的进一步研究将有利于发掘其在预测不良妊娠结局中的价值。